蜂膠防治奶牛乳腺炎研究進展

歐愛群，趙必安，李江紅，王凱，彭文君

(1. 福建農林大學蜂學學院,福建 福州 350002;2. 中國農業科學院蜜蜂研究所,北京 100093)

乳腺炎(mastitis)是由乳房組織感染引起的炎癥反應，對奶牛影響最為嚴重，不僅危害奶牛健康，同時也會造成牛奶產量減少和品質的下降[1]。國內外治療奶牛乳腺炎的藥物主要是青霉素、鏈霉素等抗生素，但由于在實際生產過程中抗生素的大量使用導致了各種多重耐藥菌的持續出現，這也使得近年來奶牛乳腺炎的治愈率逐年降低[2]。此外，抗生素濫用也直接導致了牛奶中各類抗生素和毒素的殘留，嚴重影響牛奶的品質，威脅人類健康。因此，迫切需要開發替代抗生素的方法用于預防和治療奶牛乳腺炎。研究結果表明，部分天然產物無毒、無害、無有害殘留，并對預防和治療奶牛乳腺炎有效，已經逐步替代抗生素成為預防和治療奶牛乳腺炎的新技術和方法。在促進動物生長、提高飼料利用率、增強動物疾病抵抗能力、減少抗生素使用和改善提高肉類產品品質等方面可以發揮巨大作用[3]。蜂膠是蜜蜂采集植物芽孢或樹脂，混入其上腭腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物，作為一種動植物雙源性純天然產物，具有多種生物活性及藥理作用。近年來國內外對蜂膠在畜禽飼養及畜禽疾病防治上進行了廣泛的研究，并取得可喜的成果[4]。本文針對利用蜂膠防治奶牛乳腺炎的相關研究及應用情況進行綜述，以期為臨床上利用蜂膠有效防治奶牛乳腺炎提供參考。

1 奶牛乳腺炎

1.1 病因

奶牛乳腺炎是由于感染病原體(乳房內感染，IMI)、損傷、過敏或腫瘤引起的乳腺實質炎癥。乳腺炎根據臨床表現可分為臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎。柴生對甘肅、寧夏、武漢等地區的規模奶牛場進行調查時發現，在3 000頭奶牛中，患有臨床型乳房炎、隱性乳房炎的發病率分別為13.1%和15.6%[5]。沈陽陽等[6]調查發現，江蘇省大生源牧場奶牛臨床型乳腺炎發病率為14.3%，亞臨床型乳腺炎發病率為9.5%，隱性乳腺炎的發病率為15.6%。引起奶牛發生乳腺炎的病因較多，主要包括奶牛自身因素、營養因素、環境因素和病原微生物。其中病原微生物是導致奶牛乳腺炎易感多發的主要原因。病原微生物也可分為傳染性病原體和環境性病原體2類。傳染性病原體主要定植于乳腺，常在擠奶過程中傳播，主要包括金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactia)、牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis)以及牛支原體(Mycoplasmabovis)等[7]；環境病原體需要一定外界條件才能生存，因此導致奶牛患病存在一定的隨機性，主要包括乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷菌屬(Serratia)以及假單孢桿菌屬(Pseudomonas)[8]。乳腺炎看似為一般的奶牛疾病，但有著嚴重的危害性，由乳腺炎造成的經濟損失主要包括獸醫治療費用增加、牛奶產量以及品質下降、生育率降低、甚至因感染而導致奶牛死亡。

1.2 臨床癥狀

根據奶牛乳腺臨床發生癥狀以及乳汁變化情況，可分為急性乳腺炎、慢性乳腺炎和隱性乳腺炎[9-10]。

急性乳腺炎：奶牛患區乳房腫脹、發紅、疼痛明顯，乳汁呈淡黃色或黃白色，產乳量減少，此外健康乳房的產奶量也顯著下降。

慢性乳腺炎：如果急性乳腺炎不能完全治愈就會轉化成慢性乳腺炎，患病奶牛不會出現明顯的全身癥狀，其中乳汁呈灰白色，乳中有凝塊或絮狀物，乳房腫脹，疼痛不明顯，產乳量變化不大。

隱性乳腺炎：患隱性乳腺炎的奶牛不會表現出炎癥癥狀，但發病率極高，超過總發病率的50%以上，通常容易被飼養員或擠奶員忽略，進而造成嚴重的經濟損失。患病奶牛乳汁中病原菌、體細胞數量急劇增加；經pH試制檢驗可得，乳中pH 值呈堿性,其中堿性越高,病情越嚴重。

1.3 發病過程

微生物感染引起乳腺炎包括三個階段:① 侵入階段，此階段主要是病原菌破壞皮膚屏障，通過乳頭管侵入; ② 感染階段，此階段主要是病原菌在乳池中存活并增殖、向乳腺其他部位擴散的階段; ③炎癥階段，此階段主要是以乳體細胞數(SCC )升高為主要特征的炎癥反應階段，在此階段乳腺炎的臨床癥狀逐漸顯現。細菌一旦侵入乳房，首先可能會被乳腺中的免疫細胞清除[11]。但如果未被徹底清除，細菌會在乳腺中繁殖并釋放毒素誘導白細胞和上皮細胞產生大量炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α，白細胞介素-8，白細胞介素-1，類二十烷酸，急性期蛋白(APPs)等[12]。這些炎癥介質進而會通過吸引循環免疫效應細胞進入感染部位，釋放氧化劑和蛋白酶來破壞細菌和清除受感染的乳腺上皮細胞。隨后，巨噬細胞吞噬剩余的多形核中性白細胞。除死亡的白細胞外，死亡和脫落的乳腺上皮細胞也會分泌到乳汁中，導致牛奶中SCC 急劇上升[13]。

1.4 治療措施

目前臨床上對于奶牛乳腺炎的治療還是以使用抗生素為主，相關經典方法也是針對哺乳期乳腺炎臨床病例[14]。在臨床上使用的抗生素主要包括青霉素、四環素、氨芐西林等。抗生素治療乳腺炎的優點是治療目標明確，易于使用，且適合現代乳品管理系統，治愈率高。但其明顯缺點是導致牛奶中可能存在的抗生素殘留，且容易使細菌產生耐藥性。因此，為避免使用抗生素造成的危害，一些補充/替代療法也被廣泛應用于奶牛乳腺炎的防治。迄今為止，研究最多的抗生素替代品主要包括沸石、臭氧和中草藥。Morinaga等[15]在80頭患有乳腺炎的荷斯坦奶牛飲食中給藥200 g/頭/天沸石粉，發現與未給藥組相比，飲食沸石組奶牛乳中的SCC呈現出明顯下降的趨勢，表明飲食沸石對防治奶牛乳腺炎有一定的作用效果。Ioffe等[16]應用臭氧輸注到受乳腺炎影響的乳區，其形式已被證明是有效、安全和經濟的，有效避免了牛奶中藥物殘留的風險。部分中草藥作為純天然物質，具有抗菌、消炎、調節機體免疫力和增強機體對病原體的抵抗等多種優點。葉東東等[17]研究了雙黃連注射液、地丁菊蓮注射液和魚腥草注射液對患乳腺炎泌乳牛的治療效果，結果表明，3種中草藥注射液對治療隱性乳房炎均有一定的療效，可以有效緩解牛乳腺炎性癥狀、降低牛乳中SCC數量，其中注射魚腥草注射液后即產生較好的療效且持續時間較長；并且對控制高SCC的隱性乳腺炎發展成臨床型乳腺炎有積極的預防作用。盡管中草藥及其有效成分對治療奶牛乳腺炎有一定的效果，但中草藥的成分復雜，治療機理還尚未明確，對奶牛及乳品的影響還有待于進一步研究。

2 蜂膠及其抗炎作用

蜜蜂利用蜂膠清理蜂巢內壁，并封住蜂巢上的洞，同時也用于覆蓋蜂巢內入侵者的尸體，避免它們的腐爛而影響蜂巢環境。人類利用蜂膠的歷史非常久遠。據記載，在古希臘，蜂膠被用作皮膚和頰部感染的消毒劑和防腐劑。蜂膠的活性成分十分復雜, 主要包括黃酮類、酚酸類、萜烯類等多種化合物。蜂膠的化學組成取決于蜂膠的植物來源、采集季節和采集蜜蜂種類。由于蜂膠具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫調節、抗氧化等多種藥理活性，現已廣泛應用于醫療保健、食品加工、化妝品、畜牧獸醫等多個領域。蜂膠抗炎活性十分突出，而炎癥也是多種疾病共生的土壤，近年來關于蜂膠抗炎作用的研究見表1。

表1 近5年蜂膠抗炎研究進展情況

材料地理來源實驗模型抗炎作用評價參考文獻AEP土耳其LPS誘導大鼠眼葡萄膜炎癥減少睫狀體NF-κB/p65免疫反應活性,降低TNF-α和HIF-1α的表達水平[18]EEP中國LPS與IFN-γ誘導RAW264.7細胞炎癥抑制炎性細胞因子的分泌,阻止NF-κB的激活[19]EEP巴西LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥降低促炎因子( IL-12, GM-CSF, IFN-?, IL-1β )的產生,抑制NF-κB和MAPK信號通路[20]EEP中國臺灣MSU誘導小鼠腹膜炎減輕腹膜中性粒細胞聚集,降低IL-1β,半胱天冬酶-1,IL-6和單核細胞趨化蛋白-1的水平[21]EEP馬來西亞鏈脲佐菌素誘導大鼠模型降低 IL-1β、TNF-α的表達,緩解炎癥癥狀[22]EEP巴西LPS激活腹腔巨噬細胞模型降低NO水平、減少促炎細胞因子和基因的釋放和表達[23]EEP印度尼西亞炎癥大鼠牙髓組織顯著抑制炎癥因子IL-6的表達[24]EEP中國DSS誘導大鼠結腸炎改善結腸炎癥狀,腸道微生物多樣性顯著增加[25]EEP日本LPS刺激的RAW 264.7細胞炎癥模型顯著降低亞硝酸鹽積累和COX-2活性[26]EEP土耳其LPS誘導大鼠急性肝和肺炎癥減少NO的釋放,SOD和CAT值升高,緩解炎癥癥狀[27]

注：AEP-蜂膠水提液；EEP-蜂膠乙醇提取液

3 蜂膠防治奶牛乳腺炎的作用

3.1 蜂膠抑制或殺滅奶牛乳腺炎病原

奶牛乳腺炎的病原微生物多達150余種，其中以細菌最為常見。在對乳腺炎的防治過程中，由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染而引起的乳腺炎的治療最為困難，但蜂膠因其良好的抗菌活性被廣泛用于抗生素替代治療細菌感染導致的奶牛乳腺炎。蜂膠因提取方式、地理來源的不同，對奶牛乳腺炎分離菌的抗菌效果存在一定的差異(表2)。有研究發現蜂膠可能是用于臨床、亞臨床乳腺炎常規抗菌藥物很好的替代物，并且對鼠、山羊和奶牛等動物建立體內、體外模型進行了研究驗證。Bacic等[28]利用蜂膠提取物對對常見乳腺炎病原菌的體外抗菌作用和荷斯坦奶牛的臨床試驗。結果證明，1%的乳內蜂膠制劑在體外和體內均具有較高的抗菌和抗氧化活性。Wang等[29]以奶牛乳腺上皮細胞為研究對象，利用多種乳腺炎病原菌誘導建立細胞炎性損傷模型，發現15 μg/mL的蜂膠對奶牛乳腺炎病原微生物誘導的乳腺上皮細胞損傷具有較好的保護作用。

3.2 蜂膠降低奶牛乳腺炎癥反應

奶牛乳房炎臨床表現癥狀主要是炎性反應，主要包括乳房腫脹、發紅、發熱，伴有疼痛，牛奶顏色變化、凝塊外觀以及細胞數量增加。因此在治療乳房炎時應著重注意消除炎癥。朱建英[38]采用復方蜂膠擦劑對臨床性奶牛乳腺炎進行了治療研究，結果發現，乳汁中的絮片、凝塊消失，患病乳區紅、腫、熱、痛癥狀消失，牛奶外觀正常，泌乳量回升；且亞急性奶牛乳腺炎的有效治愈率達90%。木村直美等[39]利用黃連、蜂膠和乳沒制成奶牛乳頭浸蘸劑，對患有隱性乳腺炎奶牛(63頭252個乳區)進行臨床試驗，結果發現乳頭浸蘸劑對奶牛隱性乳腺炎有一定的防治作用。劉謝榮等[40]研究也發現利用蜂膠制成乳頭浸蘸劑對奶牛隱性乳腺炎有較好的防治效果。Bacic等[28]利用1%的乳內蜂膠制劑對患有亞臨床乳腺炎的奶牛進行試驗，發現經3次使用后，乳汁中的體細胞數目降低、乳房內感染率下降。結果表明1%的乳內蜂膠制劑對預防和治療奶牛的亞臨床乳腺炎有一定的效果。Wang等[29]建立大腸桿菌脂多糖LPS和金黃色葡萄球菌脂磷壁酸LTA誘導奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應模型，發現在給藥15 μg/mL的蜂膠后，能有效降低促炎因子的表達，進而減緩細胞炎癥反應。 Bueno-Silva等[41]研究表明巴西紅蜂膠能有效減少中性粒細胞向炎癥部位的流入，主要是通過減少細胞因子TNF-α，IL-1β，CXCL1/KC和CXCL2/MIP-2釋放起作用，并通過阻斷鈣內流來減少中性粒細胞的趨化性，進而發揮抗炎效果。

表2 蜂膠治療奶牛乳腺炎抗菌作用研究

材料蜂膠來源試驗菌種抗菌效果參考文獻AEP巴西Staphyloccocus spp.30%濃度下表現出較好的抗菌效果[30]EEP巴西Staphyloccocus aureus1 mg/mL濃度下具有較好的抗菌效果[31]EEP羅馬尼亞Staphyloccocus aureus對敏感性S.aureus抗菌濃度為0.125%～2%,耐抗生素S.aureus為2%～4%[32]HAEP巴西Escherichia coli; Staphyloccocu spp.; Streptococcus spp.25 mg/mL濃度下對S.aureus、Streptococcus spp.有較強的抗菌作用[33]EEP克羅地亞Staphyloccocus aureus1%的乳內蜂膠制劑表現出較高的抗菌活性[28]EEP巴西Staphyloccocus aureus; Escherichia coli濃度為0.75 mg/mL和1 mg/mL時,蜂膠對S.aureus生長減少到平均為零,但對E.coli的影響較弱[34]EEP哥倫比亞Staphylococcus spp.MIC:11.88 mg/mL～51.25 mg/mLMBC:1.87 mg/mL～30 mg/mL[35]MEPEAEP巴西Staphyloccocus aureus蜂膠在不同溶劑中的MBC分別為:甲醇0.375 mg/mL,乙酸乙酯3 mg/mL[36]EEP阿爾及利亞Staphyloccocus aureus;Pseudomonas aeruginosa蜂膠對S.aureus的MIC范圍為0.4%～1.6%,對P.aerugino-sa效果不明顯 [37]

注：AEP-蜂膠水提液；EEP-蜂膠乙醇提取液；MEP-蜂膠甲醇提取液；HAEP-蜂膠水醇提取液；EAEP-蜂膠乙酸乙酯提取液

3.3 蜂膠作為疫苗佐劑增強免疫功能

乳腺炎是奶牛常見的、多發的疾病之一，與病原性細菌、飼養環境等多因素密切相關，難以控制和徹底治愈。不同地區的奶牛乳腺炎的主要病原菌不盡相同，具有地區差異性，這使得對乳腺炎的防治不能完全照搬其它地區的預防和治療措施。針對這些難題，研究人員考慮通過開發針對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌的疫苗來預防奶牛乳房炎。但是這些疫苗存在效力不普遍以及沒有穩定性等問題，沒有得到大范圍的應用。羅金印等[42]采用4種不同佐劑的奶牛乳腺炎多聯滅活疫苗進行兔免疫攻毒試驗，結果表明，蜂膠疫苗效果最好，鋁膠疫苗次之。并且不同佐劑多聯疫苗在接種泌乳牛后，與對照組相比，蜂膠疫苗組臨床性奶牛乳腺炎的發病率降低了65.6%。劉賀生[43]研制出預防奶牛乳腺炎蜂膠佐劑滅活疫苗，以0.1～0.2 mL/只免疫劑量注射小鼠，采用ELISA方法檢測免疫小鼠產生的抗體水平，后建立小鼠關節炎攻毒模型。結果表明，蜂膠佐劑滅活疫苗能夠為攻毒試驗小鼠提供有效的保護。李美榮等[44]以0.4%的甲醛作為滅活劑，以蜂膠作為佐劑制備1∶1的比例等體積混合奶牛隱性乳房炎多價蜂膠滅活疫苗，并建立小鼠模型找出最佳免疫劑量。結果發現，在小鼠攻毒試驗之前注射奶牛隱性乳房炎多價疫苗的混菌液，滅活疫苗的保護率達 86.4%，表明制備的奶牛隱性乳房炎多價蜂膠滅活疫苗的混懸液具有良好的免疫保護效果。

3.4 蜂膠活性單體治療奶牛乳腺炎

近年來針對蜂膠中生物活性單體的研究呈現明顯的上升趨勢，研究報道蜂膠中起主要抗炎作用的化合物主要為黃酮類化合物(槲皮素、山柰酚、高良姜素等)和酚酸類化合物(咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸等)，以及一些酚酸類的衍生物，如咖啡酸苯乙酯，阿替匹林C等。槲皮素是一種膳食類黃酮，對炎癥、血管生成、血管炎癥、和膽固醇轉運有一定的抑制作用。Burmańczuk等[45]研究了對患有臨床性乳腺炎的奶牛給藥兩種不同劑量的槲皮素，發現從給藥后的第1～8天，牛奶中體細胞數(SCC)呈現明顯下降趨勢，表明槲皮素對臨床性奶牛乳腺炎具有一定的治療效果。Liu等[46]試驗表明，咖啡酸通過降低促炎因子的表達，減弱核轉錄因子κB的轉錄活性來起到對LPS誘導的牛乳腺上皮細胞炎癥損傷的保護作用。

4 結語

盡管有多種預防措施和治療手段，乳腺炎仍然是造成奶牛養殖業巨大經濟損失的嚴重疾病，這也是由多種致病因素、奶牛對感染的易感性、飼養環境條件以及奶牛自身免疫功能強弱等因素共同作用的結果。蜂膠作為一種天然無毒害的物質，具有多種生物活性及藥理功能，在奶牛乳腺炎的防治過程中起到較好的效果，能夠有效的解決乳腺炎治療中抗生素殘留等問題，但蜂膠在治療奶牛乳腺炎的作用機制尚未明確。因此，在之后的研究工作中，應深入研究蜂膠防治奶牛乳腺炎的作用機制，為利用蜂膠開發治療乳腺炎藥物提供新的思路。