大鼠鞘內給藥方法比較及改進*

崔秀玉 周 巖,2

(1.北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，首都醫科大學腦重大疾病研究中心，北京 100069)(2.首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系，北京 100069)

直接向脊髓輸送藥物技術的出現給科學家探討脊髓功能、藥物的神經毒性、疼痛傳遞過程及鎮痛機制提供了無限的可能性。在鎮痛領域，直接鞘內給藥方法的建立給臨床患者提供了新的鎮痛方式的選擇，尤其是不能進行全身麻醉的患者。直接鞘內給藥使藥物僅局限于脊髓局部，不但用藥量少，而且也避免了全身毒副作用。鞘內給藥的另一個優勢是不能通過血腦屏障的藥物可以直接髓鞘內給藥[1]。實驗研究中，鞘內給藥方式可以分為一次性和慢性多次。一次性給藥方式為腰椎直接穿刺法，慢性多次給藥時除了反復直接腰椎穿刺外，另一種方法是鞘內置管，也稱為蛛網膜下腔置管[2]。多次反復急性腰椎穿刺不但增加了實驗者的操作次數，且易造成反復損傷和感染，所以需要慢性鞘內給藥時多采用鞘內置管術。目前鞘內置管術可以分為：經枕寰膜鞘內置管、腰骶部椎間孔鞘內置管。

鞘內置管后，傳統給藥方式是經置管末端反復多次給藥。近些年由于微型滲透泵的出現，可將置管末端與微型滲透泵相連，提供了一種鞘內連續給藥方法的選擇。在諸多的實驗動物中，大鼠是使用最多的實驗動物，占實驗脊椎動物的80%以上[3]，因此，本研究應用大鼠作為研究主體，擬應用經枕寰膜置管、腰椎椎間孔置管、經枕寰膜置管+微型滲透泵、腰椎椎間孔置管+微型滲透泵四種鞘內給藥模型，對比4種模型的優劣性，為慢性鞘內給藥方式的選擇提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取成年健康、體質量250～300 g的雄性Sprague-Dawley大鼠72只，由首都醫科大學動物實驗中心提供(SYXK(京)2018-0003)。動物隨機分成6組：經枕寰膜置管組(A)、腰椎椎間孔置管組(B)、經枕寰膜置管+微型滲透泵組(C)、腰椎椎間孔置管+微型滲透泵組(D)，每組15只大鼠。枕寰膜置管(E)和腰椎椎間孔置管(F)兩組假手術組，每組6只。 動物飼養條件：室溫23～24°C，12 h/12 h明暗循環，每籠飼養1只動物，可自由獲取食物和水。動物操作規程遵照首都醫科大學動物保護與使用委員會的規定執行。實驗結束后腹腔注射戊巴比妥鈉深麻處死動物(200 mg/kg體質量)。

1.2 主要儀器設備與試劑

SR-6R型腦立體定位儀(Narishige, Japan)；rotarod轉棒儀(Ugo Basile,Italy)；von frey足底機械刺激儀(Ugo Basile, Italy)；Plantar Test足底熱刺激儀(Ugo Basile，Italy)微型滲透泵(Alzet Osmotic Pump，USA)； PE10 (Polyethylene tubing, USA)；戊巴比妥鈉(sigma, USA)。

1.3 經枕寰膜鞘內置管

按照文獻的方法進行經枕寰膜鞘內置管[4-5]。戊巴比妥鈉(40 mg/kg，i.p.)麻醉下，將大鼠固定于腦立體定位儀，剃毛，消毒。找到枕骨與頂骨之間的連接骨縫，正中線沿骨縫上下緣切開約1 cm的皮膚切口，鈍性分離皮下筋膜，暴露肌肉。沿骨縫邊緣將附著的肌肉分別向左右兩側鈍性剝離，此時可見白色的枕骨。沿枕骨向尾側鈍性剝離肌肉及筋膜可暴露附著于枕骨下緣和寰椎的枕寰膜(圖1)。繼續剝離肌肉和筋膜，直至枕寰膜清晰透明。用尖端彎曲的注射器針頭沿枕骨下緣橫向輕輕劃破枕寰膜，可見清亮腦脊液溢出，將PE10導管經切口處盡量水平從頭側向尾側插入。插入前需要讓鼠頭前傾，讓下巴貼近胸。插入時同時牽拉鼠尾盡量使大鼠后腦和脊椎呈水平狀態。插入過程中出現阻力加大，應將導管撤后一點調整導管方向/動物體位或者向內注射1～3 μL人工腦脊液后再慢慢插入。導管插入前應測量容量并充滿生理鹽水或人工腦脊液。導管插入預期長度后，縫合法或者阻隔法將導管錨定于肌肉或皮膚內，然后將游離端從頭頂皮膚穿出， 逐步縫合肌肉、筋膜和皮膚，封閉導管末端，消毒。小心將處于麻醉狀態的大鼠置于籠內，保溫待醒，單籠飼養。7 d后合格者方可進行后續實驗。

圖1 經枕寰膜置管示意圖注：藍色箭頭：枕骨，黃色箭頭：枕寰膜Fig.1 Diagram of catheter implantation throughatlanto-occipital membraneNote：blue arrow: occipital bone；yellow arrow:atlanto-occipital membrane

7 d恢復期中密切觀察大鼠狀態。若插管時造成神經或脊髓損傷，大鼠會立即表現出跛行或癱瘓。其它不良狀態包括眼睛鼻子炎性分泌物、毛色發黃蓬亂、體質量下降、缺乏活力，出現以上癥狀的大鼠應剔除實驗。

經枕寰膜置管聯合應用微型滲透泵(Alzet Osmotic Pump)時，導管置入成功后縫合筋膜及肌肉，游離端接入已經處理好的微型滲透泵。將微型滲透泵放入后頸處皮下擴張而成的囊中，縫合皮膚。

1.4 腰骶部鞘內置管

按照文獻[6]的方法并加以改變以利于微型滲透泵的植入。大鼠麻醉方法同上，大鼠麻醉后置于手術臺上，常規備皮消毒。實驗者用左手拇指和中指分別觸摸大鼠雙側髂嵴并向兩側繃緊皮膚，食指于兩側髂嵴連線同一水平觸摸大鼠脊椎，觸及的最高點即為L6 棘突(圖2)。以L6棘突為中點做一約1 cm的縱向切口，鈍性分離筋膜及脊椎兩邊的肌肉，去掉L6棘突。此時可見L6與L5之間的椎間孔，用彎針小心刺破椎間孔的硬脊膜，可見清亮腦脊液流出。將充盈生理鹽水的PE10導管小心從椎間孔水平向頭側端插入約3 cm。阻隔法將導管游離端固定于皮膚，逐層縫合肌肉、筋膜及皮膚。封閉導管末端，消毒。小心將處于麻醉狀態的大鼠置于籠內，保溫待醒，單籠飼養。1 d后合格者方可進行后續實驗。

經腰椎椎間孔聯合應用微型滲透泵時，接入微型滲透泵放置于皮下囊袋中。

圖2 L6棘突示意圖注：紅線：左右兩側髂嵴連線，與脊椎相交點即為L6棘突Fig.2 Diagram of L6 lumbar spinousNote：Red line: connecting line between left and right iliac crest,intersection point with the spine is L6 lumber spinous

1.5 行為學檢測

1.5.1痛行為學檢測:所有痛行為學測試之前，大鼠均需提前適應測試環境3 d，每天2 h。

分別測試各組大鼠術前及術后1 周單足的熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal lantency, PWL)和機械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal threshold, PWT)。采用von frey系統測定機械刺激縮足反射閾值。動物不發生縮足反射最大施加壓力為50 g，以免損傷大鼠足底。每個時間點至少進行3次測量，兩次測量間隔3 min。3次測量平均值被視為該時間點的機械刺激縮足反射閾值。

應用輻射熱照射法檢測大鼠熱刺激縮足反射潛伏期。每個時間點重復測量3次，間隔3 min，取其均值作為此時間點的熱刺激縮足反射潛伏期。為保護足底皮膚，照射20 s后自動斷開。

剔除術前熱刺激縮足反射潛伏期和機械刺激縮足反射閾值過低的大鼠，合格大鼠進行后續實驗。

1.5.2運動能力行為學檢測:參照文獻方法[7]，采用Rotarod轉棒儀檢測大鼠手術前后運動能力的變化。測試前2 d 大鼠在10 r/min勻速轉棒上每天適應2次，每次2 min，連續適應2 d。剔除運動能力有問題大鼠。

手術前及術后1 周進行運動能力測試。將大鼠放置于0 r/min轉棒上，采用加速模式，每10 s增加3 r/min，直至終速達60 r/min，終止時間為300 s，記錄大鼠落棒時間。每只大鼠測試3次，間隔時間20 min，取其均值。

痛行為學及運動能力行為學檢測反應術后脊髓神經是否受到損傷。

1.6 統計方法

數據均表示為均數±標準誤(mean±S.E.M)。統計方法采用GraphPad Prism統計軟件的雙因素方差分析(two way ANOVA)，然后進行兩兩比較(Tukey’s)檢驗。顯著性水平：P<0.05。

2 結果

2.1 經枕寰膜置管和經腰椎椎間孔置管對大鼠致死、致癱和體質量的影響

一般情況觀察：經枕寰膜置管的存活大鼠手術恢復期長，手術成功的大鼠5～7 d后基本恢復術前狀態。15只行經枕寰膜置管手術大鼠死亡1只(術后未蘇醒)；致癱2只；鼻口炎性分泌物2只；毛色發黃、體質量降低、精神萎靡4只(含口鼻炎性分泌物2只)；全部未脫管。7只大鼠(近50%)不合格，余8只合格可進行后續實驗(表1)。

表1 不同置管手術方式對大鼠致死、致癱、一般狀態的影響Table 1 Effect of different catheterization on death,paralysis and weight loss of rats

經腰椎椎間孔置管的大鼠術后恢復期短，1～2 d即基本恢復術前狀態。15只行腰椎椎間孔置管的大鼠全部存活，未見致癱。一般情況良好，未見口鼻炎性分泌物、體質量降低及精神萎靡。由于置管游離端位于腰骶部，大鼠容易將置管咬掉或拔出，共有5只大鼠脫管。余10只大鼠可進行后續實驗(表1)。

枕寰膜置管+滲透泵組，一般情況和單純枕寰膜置管類似(表1)。

腰椎椎間孔置管+滲透泵組一般情況和單純腰椎椎間孔置管一樣，無致死、致癱，一般情況良好。由于滲透泵置于皮下，全部未脫管。15只大鼠均可進行后續實驗。

各組可用于后續實驗的大鼠，其術前、術后體質量分別與其它組術前、術后相比，差異無顯著性。同樣，組內術前、術后體質量變化差異也無顯著性(圖3)。

圖3 各組大鼠術前、術后體質量變化Fig.3 Weights of rats before and after surgery

2.2 經枕寰膜置管和經腰椎椎間孔置管對大鼠基礎痛閾的影響

各組大鼠術前PWL和PWT組間、組內差異均無顯著性，表明術前各組大鼠的基礎痛閾無明顯差別。

經枕寰膜置管和腰椎椎間孔置管兩組的假手術組大鼠手術前后熱刺激和機械刺激基礎痛閾未發生顯著變化。單純手術不置管并未影響大鼠基礎痛閾。

經枕寰膜置管術后1 周， PWL和PWT降低，與術前和假手術組相比差異具有顯著性(P<0.01，圖4A,4B)。提示經枕寰膜置管可導致大鼠產生痛敏。并且經枕寰膜置管大鼠的PWL、PWT也顯著低于經腰椎椎間孔置管大鼠，差異顯著(P<0.01)。

同樣，在術后1 周 檢測腰椎椎間孔置管大鼠的PWL和PWT，與術前和假手術組相比，置管大鼠的痛閾未見明顯降低，統計學處理差異無顯著性(P>0.05)。

經枕寰膜置管可降低大鼠基礎痛閾，產生痛敏。而經腰椎椎間孔置管不影響大鼠基礎痛閾。

2.3 經枕寰膜置管和經腰椎椎間孔置管對大鼠轉棒運動能力的影響

術前及術后1周分別檢測各組大鼠轉棒運動能力。結果如圖4C所示，各組大鼠術前轉棒時間統計學上差異無顯著性。經枕寰膜置管組及經枕寰膜置管+微型滲透泵組在術后轉棒時間顯著低于術前及其它術后組，提示經枕寰膜置管損傷脊髓神經組織，影響大鼠的運動能力。

圖4 不同置管方式對大鼠基礎痛閾及運動能力的影響注： 與同組術前比較,**P<0.01, ***P<0.001;與A, B, D, F組術后比較, ##P<0.01, ###P<0.001Fig.4 Effect of different catheterization on painbehavior and rotarod performanceNate：compared with before surgery in the same group,**P<0.01,***P<0.001; compared with after surgery in A, B, D, F groups,##P<0.01, ###P<0.001

3 討論

經枕寰膜置管和腰椎椎間孔/穿刺給藥仍是目前實驗研究中常規使用的向鞘內給藥的兩種方式[8-13]，由于經腰椎椎間孔脫管率很高的缺點，實驗者更愿意采用操作難度大，易造成神經損傷的經枕寰膜置管的方式。

經枕寰膜置管術最早在1976年由Yaksh和Rudy報道[4]。這項技術徹底改變了對疼痛和鎮痛的研究，其廣泛應用極大地促進了我們對脊髓生理功能、鎮痛、慢性疼痛和阿片類藥物耐受過程的理解。在麻醉下進行手術、導管定位，藥物可以以定點的方式輸送至特定位置。實驗完成后，可以將染料注射至與藥物完全相同的位置，用于導管和藥物放置的組織學驗證。這種方法允許多次甚至連續(連接微型滲透泵)地向不同脊髓水平輸入藥物，不需要反復多次地進行腰椎穿刺，避免了反復穿刺可能造成的神經損傷。

本置管術的缺點也很明顯，首先要對動物進行手術，不但費用增加且與單次穿刺相比，實驗者的勞動強度也增加。其次，與腰椎穿刺相比，動物在術后需要相對較長的恢復期，一般來說需要5～7 d。最后也是最嚴重的缺點是所置入導管需要從頸髓經胸髓到達腰髓，由于髓鞘腔狹窄容易對脊髓造成壓迫性損傷[14]，導管尖端易形成瘢痕組織[15]，且易引發炎癥反應[16]。這些損傷可致動物一側甚至雙側后肢的跛行乃至癱瘓。另外，植入導管可發生脫管或者移位，有時甚至會移至脊髓腹側。這就需要實驗后對每只實驗動物進行導管位置的確認，從實驗數據中剔除導管移位的個例。導管植入引起的脊髓損傷，鞘內出血、位置移位及脫管、髓鞘內炎癥等并發癥可能造成20%～30%的實驗動物數據流失[14-16]。該置管術另一個比較顯著的劣勢是植入導管有一定的難度和技巧，實驗者必須經過反復練習。即使經過培訓和練習的實驗者仍不能保證全部的實驗動物均能符合實驗需要。本實驗共15只大鼠行經枕寰膜置管術，由于死亡、偏癱、體質量降低原因，僅余8只可進行后續實驗，造成實驗動物不必要的痛苦和浪費。術后7 d，可進行后續實驗的大鼠其運動能力下降，后足基礎痛閾降低，說明即使該組大鼠未發生明顯癱瘓及健康方面問題，但其運動行為學和疼痛行為學仍發生顯著變化，應引起進行相關領域研究者的注意。

腰骶部鞘內置管術是Martin等在1984年首次提出[6]，目前文獻中腰骶部鞘內置管方法基本沿用了此方法。與經枕寰膜置管相比，此法顯著降低了脊髓壓迫及神經根損傷等創傷，行為學上不會出現軟癱及癱瘓等神經受損的表現。動物體質量、毛色、狀態都保持正常[16]。但此法顯著的一個缺點是大鼠極易容易將留置管游離端咬掉，致使后續實驗無法進行。正如本實驗觀察結果，約三分之一的大鼠因此而退出實驗。該方法要求操作者必須有一定的經驗積累，經皮膚、皮下肌層、黃韌帶和硬脊膜進行盲穿，這給操作者帶來一定的挑戰。為了降低操作難度并給微型滲透泵創造植入空間，本實驗將腰椎棘突去掉，使得椎間孔暴露在操作者視野中，便于操作。

不管是經枕寰膜置管還是腰骶部鞘內置管，對動物進行慢性實驗需要反復多次給藥時，需要留出較多時間安撫動物，趁大鼠不反抗時盡快將藥物注入。單次重復給藥也使得體內藥物濃度出現峰谷。為了解決脫管和反復多次給藥的問題，本實驗聯合應用微型滲透泵。腰椎椎間孔結合微型滲透壓泵的方法完全改善了大鼠咬掉置管游離端的弊端，15只行該方法的大鼠全部可用于后續實驗。結合微型滲透泵的方法不但避免了反復給藥繁瑣的缺點，動物也免于反復的驚嚇。由于使用了滲透泵，藥物濃度也始終維持同一水平。根據給藥時間的需要，可以選擇不同規格的滲透壓泵，基本可以滿足持續給藥3 d至28 d的需求。

不管是枕寰膜置管還是腰椎椎間孔，由于所置導管末端均裸露于皮膚之外，術后為了避免大鼠啃咬脫管只能單籠飼養。其缺點一是占用太多飼養空間，增加飼養人力和物力；二是慢性實驗時，長期單籠飼養易至大鼠出現社會孤立綜合征，導致行為學檢測及實驗失敗[17]。使用微型滲透泵置于皮下可以多只同籠飼養，避免了以上兩個缺點。

腰椎椎間孔結合微型滲透泵術后大鼠無致死、致癱，狀態佳，而且動物恢復時間也比較短，24 h即可進行后續實驗。此法可用于臨床藥代及藥物毒副作用的研究，應用前景廣泛。