ISSR分析崇明白山羊的遺傳多樣性及親緣關系

陳 曉，戴建軍，李 垚，吳彩鳳，張樹山，孫玲偉，張德福，李 麗

(1上海農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3錦州醫科大學畜牧獸醫學院，錦州 121001；4上海交通大學醫學院，上海200025)

崇明白山羊被喻為“長江三角洲白山羊”，是崇明地方特有的優良品種。崇明白山羊體型中等偏小，白色被毛，體格健壯，具有適應力強、抗病力強、產肉性能高、繁殖性能高等優質品性[1]。目前崇明白山羊飼養總量達到50萬頭左右，上海市崇明地區已對崇明白山羊農產品實施地理標志性保護。作為全國重點保護和發展的家畜品種，其在形態學、生理生化方面研究較多，但基于分子水平的研究尚少。研究崇明白山羊群體的遺傳多樣性對于該品種資源的科學有效保護及實驗動物化應用具有實際意義。

ISSR即簡單重復序列間分子標記，是基于SSR基礎之上迅速發展起來的，并廣泛應用于動植物居群遺傳學研究的一項新型DNA分子標記技術[2]。其原理是用錨定的微衛星DNA作為引物，并在SSR序列的3’或者5’端加入2—4個隨機核苷酸，對兩側具有反向排列SSR的DNA片段進行PCR擴增。該技術具有操作簡便、穩定性高、多態性豐富、試驗成本低、信息量大、適用范圍廣等優點[3-4]。本研究旨在采用ISSR技術對崇明白山羊的遺傳多樣性與親緣關系進行分析，并掌握崇明白山羊遺傳多樣性的現狀，以期對其種質資源的合理保護和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自上海市崇明地區崇明白山羊群體，由90只公羊和116只母羊組成，共計206只。每只山羊頸靜脈采血約6 mL，存放在抗凝采血管中置于-20℃備用。采用全血基因組DNA提取試劑盒提取崇明白山羊的血液基因組DNA，經2%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計測定樣品的質量和濃度，-20℃保存備用。

1.2 引物篩選

根據加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第九套100條ISSR引物序列中篩選出12條引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 ISSR引物序列

注：Y=(C,T)，R=(A,G)

1.3 PCR反應與條帶記錄

PCR總反應體系為25 μL，含模板DNA 10—20 ngμL，引物10 μmolL，氯化鎂3 mmolL，dNTP 500 μmolL，0.1U Taq DNA聚合酶。其反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 60 s，49—63℃ 60 s，72℃ 90 s，40個循環；72℃ 7 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(1×TAE,120 V,1 h)，以Marker DL 2000作為分子質量標準，通過凝膠成像系統拍照觀察。在電泳圖譜中記錄清晰可見的條帶，每一條帶記為一個位點，在指定遷移位置有條帶出現時，被認為是相同的DNA片段產物，存在擴增條帶則記為“1”，缺失條帶則記為“0”，建立譜帶“01”矩陣二元數據。

1.4 參數統計與處理

應用NTSYS和POPGEN軟件來檢測遺傳多樣性指標，分析親緣關系。各群體內遺傳參數包括：ISSR-PCR產物的總條帶數、多態性條帶數、多態位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(h)、Shannon’s多樣性信息指數(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內基因多樣性(Hs)、遺傳分化值(Gst)及基因流(Nm)。

為評估崇明白山羊群體遺傳關系，根據POPGENE計算得出遺傳相似系數和遺傳距離，使用NTSYS.pc 2.10e軟件按照非加權組平均法(UPGMA)對崇明白山羊個體間構建聚類分析圖譜。

2 結果與分析

2.1 崇明白山羊ISSR擴增結果

12條引物在206個樣本中共產生181條符合數據統計的條帶，平均每個引物擴增出15.08條，其中多態性條帶163條，占總條帶數的90.06%，部分擴增結果見圖1。

2.2 崇明白山羊遺傳多樣性

將ISSR擴增的結果轉化成0，1二元矩陣后，輸入POPGENE統計軟件，檢測到90只崇明白山羊公羊個體、116只崇明白山羊母羊個體，共206只崇明白山羊的各項指標(表2)。結果顯示，崇明白山羊群體具有較高的遺傳多樣性，其中公羊的各項遺傳多樣性水平均高于母羊。

表2 崇明白山羊群體的遺傳多樣性

組別群體總基因多樣性(Ht)群體內基因多樣性(Hs)遺傳分化值(Gst)基因流(Nm)崇明白山羊0.279 7±0.034 00.226 7±0.025 80.189 42.139 7

2.3 崇明白山羊的聚類分析

將ISSR擴增結果轉化成0，1二元矩陣后，輸入NTSYS.pc2.10e軟件中，得到206只崇明白山羊樣本的相似性系數為0.519 3—0.989 0，遺傳距離為0.147 4—0.863 0，其中204號、205號個體的遺傳相似系數最高，達到了0.989 0，說明這兩個個體的遺傳相似度較高，即兩者的親緣性較近。使用UPGMA方法對崇明白山羊個體間進行聚類分析，生成聚類圖譜(圖2)，在遺傳相似系數0.83處，可將206個群體劃分11類，第一類包括10個個體(1—10號)，第二類包括1個個體(11號)，第三類包括50個個體(12—50號，52—62號)，第四類包括1個個體(51號)，第五類包括28個個體(63—90號)，第六類包括29個個體(91—96號，98—120號)，第七類包括13個個體(170—182號)，第八類包括22個個體(121—142號)，第九類包括27個個體(143—169號)，第十類包括24個個體(183—206號)，第十一類包括1個個體(97號)，且前五類均為公羊個體，后六類均為母羊個體。

3 討論

物種遺傳多樣性的存在能夠維持物種的生存和進化能力[5]，物種在歷經漫長的時間選擇和基因突變后，遺傳多樣性也會隨之提高，物種遺傳多樣性既是評價生物進化水平的重要指標，也是維持生態系統穩定的基礎[6]，多數物種的滅絕都是因為遺傳多樣性水平的降低所造成，所以保護物種的種質資源意義重大。近年來ISSR技術在遺傳多樣性及親緣性問題的研究中已廣泛得到應用[7-9]，此項技術作為物種基因組多態性的分析，避免了環境與地理位置的限定，其多態性較高，獲得的信息量多于PAPD(隨機擴增多態性DNA)分子標記技術，精確程度可與RFLP(限制性片段長度多態性)技術相比較[10-11]。本研究采用ISSR分子標記技術對崇明白山羊大量樣本進行遺傳分析探討，以期更為準確的揭示崇明白山羊遺傳多樣性及親緣關系。

本研究結果顯示：公羊的各項遺傳多樣性水平要高于母羊，崇明白山羊整體遺傳多樣性豐富，其中PPB、Na、Ne、h、I值均高于鄭佩培等[12]使用ISSR技術對崇明白山羊的分析。遺傳分化值通常被用以衡量群體間的遺傳分化程度，參照Buso等[13]的標準，當Gst為0.05—0.15定義為中等分化程度，本研究中崇明白山羊的Gst為0.189 4，說明其遺傳分化程度較低，崇明白山羊的遺傳變異有81.06%發生在種群內，而種群間的遺傳變異僅有18.94%。基因流作為影響遺傳結構的重要因素，與種群大小并無關系，當NM值≥1時便可以防止因遺傳漂變引起的種群遺傳分化[14]，本研究中崇明白山羊的NM為2.139 7，說明崇明白山羊群體間存在一定的基因流，但遺傳漂變并不是影響崇明白山羊種群間分化的主要因素，遺傳分化的主要原因是由于種群內部的遺傳變異，崇明白山羊群體具有一定的適應能力。崇明白山羊雖然在地理分布條件上較為局限，但其遺傳多樣性水平依然穩定，但崇明白山羊的 Ne低于Na，表明在群體內存在較多低頻率的等位基因，因此應對現有低頻率基因實施有效保護，從而避免基因丟失現象的發生。

利用NTSYS.pc2.10e軟件，得出崇明白山羊的相似性系數為0.519 3—0.989 0，高于西藏日土藏山羊遺傳相似系數，后者為0.460 0—0.740 5[19]。崇明白山羊的遺傳距離為0.147 4—0.863 0，根據遺傳相似系數對崇明白山羊的個體聚類分析后，這206個個體可劃分為11個群體，其中公羊的群體樣本基本聚集一起，母羊的群體樣本也基本聚集在一起，第一類與第二類為大種公羊聚為一支，第三類與第四類為成年公羊聚為一支，第五類為小公羊與成年公羊聚為一支，第六類與第七類為成年母羊聚為一支，第八類與第九類為成年母羊聚為一支，第十類為小母羊與成年母羊聚為一支，第十一類成年母羊與小母羊優先聚為一支。可以發現97號個體與其他成年母羊群體的個體間遺傳距離較遠，說明97號個體與其他母羊的群體個體可能源自不同的類群。

種群達到瓶頸期是物種遺傳多樣性水平降低的重要因素，一旦種群的數量減少就會導致遺傳多樣性的降低，那么物種就會存在瀕臨滅絕的風險。本研究主要應用ISSR分子標記對崇明白山羊進行了遺傳多樣性和遺傳聚類的分析，初步得出了該物種的遺傳多樣性信息，研究結果有利于制定和實施有效保護崇明白山羊的遺傳資源方案。