地榆醇提物對對蝦致病菌VPAHPND生長影響及最適內參基因的篩選*

楊澤禹 廖梅杰 王印庚 張 正 韋信賢 李 彬 榮小軍

地榆醇提物對對蝦致病菌VPAHPND生長影響及最適內參基因的篩選*

楊澤禹1,2廖梅杰2,3①王印庚2,3張 正2,3韋信賢4李 彬2,3榮小軍2,3

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；4. 廣西水產科學研究院 南寧 530021)

為篩選適用于研究地榆(L.)對對蝦急性肝胰腺壞死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by, VPAHPND)抑制機理的內參基因，本文探究了地榆醇提物脅迫下VPAHPND生長的變化，并利用qRT-PCR技術探究了該條件下VPAHPND中 6種常見內參基因(、、、、和)的表達情況，利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder這5種方法對其表達穩定性進行了評估和篩選。結果顯示，地榆醇提物能抑制VPAHPND的生長，且抑制效果與濃度呈正相關。在不同濃度地榆醇提物處理條件下，這 6種內參基因擴增產物特異性良好，其中，值變化差異最小的為(CV=3.88)，變化差異最顯著的為(CV=12.53)。5種方法對6種內參基因穩定性排序略有差異，其中，GeNorm給出的穩定性排序為=>>>>；Norm Finder結果為>>>>>；Best Keeper結果為>>>>>；Delta Ct結果為>>>>>；Ref Finder綜合排名結果為>>>>>。本研究根據配對變異系數結果，最終推薦同時使用和作為該條件下內參基因。本研究為以地榆為核心藥物的AHPND防控技術的建立和從基因表達角度研究地榆對VPAHPND的作用機理提供了基礎。

急性肝胰腺壞死病(AHPND)；副溶血弧菌；地榆；內參基因；qRT-PCR

副溶血弧菌()是一種常見的致病菌，能引起石斑魚(spp.)、九孔鮑()、大黃魚()等諸多水產養殖對象病變(Shyne, 2008; Cai, 2010; 蔡林婷等, 2013)。近期發現副溶血弧菌也是引發凡納濱對蝦()重要疫病——急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)的主要病原之一(Soto- Rodriguez, 2015; Kumar, 2018; Zheng, 2018; 陳蒙蒙等, 2018; 賈丹等, 2018)。隨著綠色健康的水產養殖理念不斷深入人心，中草藥在水產病害防控中的運用受到廣泛關注(Pu, 2017)。地榆()作為常用中草藥之一，富含鞣質、皂苷等生物活性物質，具有抗炎(Yang, 2016)、抑菌(Lee, 2004)等作用。本研究團隊前期研究表明，地榆對急性肝胰腺壞死病致病株副溶血弧菌(VPAHPND)有明顯的抑制作用，且以地榆為主要成分的復方中草藥在防控由副溶血弧菌引發的AHPND時效果顯著(姜燕, 2016)。利用qRT-PCR技術探究不同濃度地榆醇提物作用下VPAHPND毒力因子的表達量及功能的變化，將有助于解析地榆對VPAHPND的作用機理，對以地榆為核心藥物的AHPND防控技術的建立具有重要意義。

在研究基因差異表達過程中，需要選擇穩定、高效的內參基因(Reference gene)對數據進行標準化處理(Vanguilder, 2008)，以校正qRT-PCR技術運用過程中因mRNA質量、反轉效率、進樣量差異等因素導致的技術誤差。Radonic等(2004)認為，理想的內參基因應在各種實驗條件、各種組織細胞中均能穩定表達，并對傳統內參基因的適用性提出質疑，并通過實驗證明了人體各組織最適內參基因并非傳統意義上的。Zhong等(1999)研究發現，癌細胞在正常和缺氧條件下和的表達水平差異顯著。這些研究表明，內參基因穩定性在不同物種、不同組織以及不同環境條件下存在差異。因此，篩選適于評價地榆對VPAHPND基因差異表達的內參基因是對地榆抑菌機理深入探究的基礎。

目前，常用的副溶血弧菌內參基因主要有、、、、和(Ma, 2015; Coutard, 2007; Li, 2013; 李沁, 2013)。本文以上述研究為基礎，利用qRT-PCR技術檢測了地榆醇提物作用下VPAHPND中這6種內參基因表達的穩定性，篩選出該條件下最穩定的內參基因，為后續地榆脅迫下VPAHPND相關基因表達研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

地榆購自北京同仁堂藥店。VPAHPND為對蝦AHPND致病菌，分離自天津患AHPND凡納濱對蝦的肝胰腺組織，保存于本實驗室-80℃超低溫冰箱。

1.2 地榆醇提藥物配制

取5 g地榆粉于燒杯中，加入70%的乙醇溶液150 ml，超聲提取50 min，置于真空抽濾機中進行抽濾，將濾液置于90℃恒溫水浴鍋中，濃縮藥液至45 ml左右，再用蒸餾水定容至50 ml，即配制成濃度為100 mg/ml的地榆醇提藥液，4℃儲存待用。

1.3 引物驗證

以金屬浴加熱法提取正常培養條件下VPAHPND的DNA為模板進行普通PCR擴增，6種內參基因引物信息見表1。普通PCR程序為：95℃ 10 min；95℃ 5 s，55℃ 34 s，72℃ 45 s，40個循環。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢法檢測條帶完整性，并通過TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 (大連寶生物公司)對目的條帶進行切膠回收，使用pMD18-T Vector Cloning Kit (大連寶生物公司)對目的基因進行克隆。將克隆好的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，驗證目的片段是否成功導入質粒。用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(大連寶生物公司)提取克隆成功菌液的質粒，并以此標準品為模板，進行qRT-PCR分析，檢測引物效率。qRT-PCR程序為：95℃ 10 min；95℃ 5 s，55℃ 34 s，72℃ 45 s，40個循環；熔解曲線分析使用Eppendorf的默認程序：95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。

1.4 實驗細菌培養及樣品采集

利用TSB培養基(Tryptic soy broth medium)對VPAHPND進行活化和擴大培養，培養條件為28℃、190 r/min恒溫振蕩培養10 h (指數增長期為8~11 h)，離心收集所培養的細菌并用1.5%滅菌NaCl溶液配制成1.0×104CFU/ml的菌液。利用地榆醇提物配制濃度分別為0、0.2、0.4、0.8和1.6 mg/ml的含藥TSB培養基，按照1‰的接種量向其中接種VPAHPND，隨后將其置于28℃恒溫振蕩培養箱中190 r/min振蕩培養。每個濃度梯度設置3個生物學重復。

自接種VPAHPND后開始計時，在振蕩培養0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22 h時從錐形瓶中取100 μl菌懸液適當稀釋，均勻涂布于固體TSB培養基上，置于28℃恒溫培養箱中培養12 h后進行平板菌落計數。

表1 候選內參基因引物序列及其相關信息

Tab.1 Nucleotide sequences of primers of the six candidate reference genes

用于提取RNA的樣品采樣時間由預實驗確定。各實驗組VPAHPND菌液濃度達到指數增長期所需的時間分別為9 h (0 mg/ml)、11 h (0.2 mg/ml)、14 h (0.4 mg/ml)、16 h (0.8 mg/ml)和17 h (1.6 mg/ml)。因此，分別在9、11、14、16和17 h采集相應實驗組的菌液，根據菌液濃度確定各組總菌量，用于RNA提取。

1.5 RNA提取和cDNA反轉錄

采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (大連寶生物公司)提取各實驗組細菌的總RNA。用NanoDrop 1000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢法檢測其條帶的完整性。利用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(大連寶生物公司)試劑盒進行反轉錄制備各實驗組qRT-PCR模板。

1.6 qRT-PCR分析

qRT-PCR擴增在Eppendorf實時熒光定量PCR儀(Mastercycler ep)上進行。采用TB Green? Premix ExTMⅡ(大連寶生物)進行熒光定量PCR擴增，qRT-PCR程序和熔解曲線分析程序同1.3。每個樣品進行3個技術重復。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測qRT-PCR產物的條帶。

1.7 數據處理

利用Eppendrof實時熒光定量PCR儀自帶的軟件程序計算各基因擴增的C值、熔解曲線效率(%)及其相關系數(2)。采用SPSS 19.0統計軟件對各基因C值進行單因素方差(One-way ANOVE)分析。分別利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder這5種方法對6種內參基因表達穩定性進行分析。其中，Best Keeper和Delta CT直接使用C值進行計算；GeNorm和Norm Finder軟件需要將C值轉化為2-ΔCt后再進行下一步計算；Ref Finder結果為前4種計算方法所得名次的幾何平均數；適宜的內參基因選擇數量以GeNorm軟件計算的配對變異系數(V/V+1＜0.15)為選擇標準。

2 結果

2.1 引物驗證結果

菌液測序結果顯示，利用pMD18-T為載體，將目的片段成功插入到感受態細胞中，并且目的片段長度與文獻中相同。、、、、和的擴增曲線均為單峰，引物效率(%)分別為1.01、1.08、0.99、0.98、1.02和0.93；相關系數(2)分別為0.998、0.998、0.999、0.994、0.998和0.998。這表明6個候選內參基因的引物特異性良好，可用于后續實驗。

由各樣品提取的RNA瓊脂糖電泳結果(圖1A)可以看出，各樣品條帶完整，與條帶亮度之比約為2∶1，同時260 nm/230 nm>2.0，表明所提取的RNA完整性良好。對樣本qRT-PCR擴增產物的瓊脂糖電泳結果顯示，6個基因片段擴增產物單一，無雜帶(圖1B)。各內參基因在不同濃度地榆作用下的熔解曲線均為單峰(圖1C~圖1H)。

圖1 各樣品RNA瓊脂糖電泳結果及引物擴增特異性檢測結果

A: 5個處理組樣品中總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖; B: 6個內參基因qRT-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖;C~H分別為、、、、和的熔解曲線

A: Total RNA electrophoretogram of five experimental groups; B: Specificity of six candidate reference genes for qRT-PCR amplification; C~H: Melting curves of,,,,,and

2.2 地榆醇提物對VPAHPND生長曲線的影響

不同濃度地榆醇提物作用下VPAHPND生長曲線見圖2。不同濃度地榆醇提物能改變VPAHPND到達平臺期的時間及平臺期高度，且地榆濃度越高對VPAHPND的抑制效果越明顯。0、0.2和0.4 mg/ml組達到平臺期的時間分別為12、14和18 h；而0.8 mg/ml和1.6 mg/ml組在培養22 h內未出現明顯的平臺期。

2.3 實時熒光定量檢測結果

VPAHPND中6個候選內參基因C值如圖3所示，其C值范圍分別為17.55~23.68 ()、17.55~25.63 ()、17.30~24.06 ()、13.28~16.80 ()、4.31~5.15 ()、16.87~19.41 ()。在所檢測的6個基因中，內參基因表達變化差異最小的為(CV=3.88)，說明在地榆對的表達影響較小。表達變化差異最顯著的是(CV=12.53)，說明地榆對表達影響最大。

圖2 不同濃度地榆醇提物對VPAHPND的生長曲線

圖3 6個內參基因在各處理組中Ct值

柱形圖上方字母不同表示差異顯著(<0.05)

Different letters on the column indicate significant difference (<0.05)

2.4 內參基因穩定性分析

利用5種方法對6個基因穩定性評價的結果見表2。由GeNorm軟件給出的內參基因穩定性順序由大到小為=>>>>，其中，最穩定的內參基因為和，其穩定指數均為0.852。由Norm Finder軟件計算出的內參基因穩定性順序由大到小為>>>>>，最為穩定的內參基因為，穩定指數為0.584。Best Keeper分析后推薦最穩定的內參基因為，其標準偏差為0.13，這6個候選內參基因穩定性順序由大到小為>>>>>。Delta CT法計算得出6個內參基因穩定性順序由大到小為>>>>>。其中，最為穩定的內參基因為，其平均標準偏差的值為1.570。Ref Finder根據上述4個軟件的結果分析后得出的綜合排名為>>>>>。

2.5 最適內參基因數量分析

根據Vandesompele等(2002)提出的方法進行數據處理，按照、、、、、的順序，計算配對變異系數(V/V+1)，當V/V+1<0.15時，表明最適內參基因個數為，且無需繼續引入其他內參基因。本實驗中，2/3=0.077 (圖4)，表明選用2個內參基因已能滿足該條件下實驗數據的標準化處理，結合候選內參基因的穩定性排序結果，最終得出這2個內參基因為S和。

表2 不同濃度地榆醇提物作用下副溶血弧菌中6個內參基因穩定性評價

Tab.2 Stability evaluation of six reference genes of Vibrio parahaemolyticus under different concentrations of Sanguisorba officinalis L. alcoholic extracts

*: 對應處理組相應軟件給出的最穩定基因

*: The most stable gene given by corresponding software of corresponding group

圖4 最適內參基因數量的確定

配對變異系數(V/V+1)是由標準化因子NF與NF+1計算所得，用于確定精確標準化處理數據時所需的最適內參基因數量

Pairwise variation (V/V+1) analysis is based on the normalization factors NFand NF+1to determine the number of control genes required for accurate normalization

3 討論

3.1 地榆醇提物對VPAHPND生長曲線的影響

地榆入藥歷史悠久，但相關的研究多集中于人醫，在水產養殖中的研究與運用較少。姜燕(2016)研究發現，地榆對副溶血弧菌有較好的抑制效果，發現地榆與訶子、烏梅、黃連聯用能顯著提高對蝦免疫力和抗病力。Lee等(2004)研究發現，地榆對表皮葡萄球菌()、金黃色葡萄球菌()和大腸桿菌()均有顯著的抑菌效果，地榆對這 3種細菌抑制效果與濃度呈正相關。本研究結果與Lee等(2004)的實驗結果一致，地榆的使用延緩了VPAHPND到達平臺期的時間及平臺期高度，并且濃度越高，作用效果越明顯。研究結果證明了地榆對VPAHPND的抑制效果，為后續以地榆為核心藥物的AHPND防控技術的建立提供了數據支持。

3.2 內參基因穩定性評價的意義

qRT-PCR技術廣泛應用于哺乳動物(Cepollaro, 2018)、植物(Chen, 2015)、細菌(Delorenzo, 2018)等各類生物體內基因表達變化的研究。在基因相對表達量分析時，需要將初始樣品量、酶效率、轉錄活性差異等變量因素進行標準化處理，以降低這些變量對實驗結果造成的誤差。數據標準化處理時，常使用內參基因法。理想的內參基因被定義為在各種組織樣品和實驗條件下均能穩定表達的基因(Zhang, 2005)。為了保證實驗結果的可信度，需要在實驗前對篩選的內參基因進行驗證。Gomes等(2018)根據實驗得出，肺炎克雷伯菌()中最為合適的內參基因組合為、、和，并通過分析肺炎克雷伯菌細胞內鐵調節基因在鐵富余和虧欠兩種條件下的相對表達量，驗證了其所篩選的內參基因的正確性。Wang等(2018)在小鼠()急性酒精性肝損傷模型中，利用內質網應激相關基因的相對表達量差異驗證了作為該模型下的內參基因的可靠性。Lin等(2018)利用和基因驗證了SO2脅迫下植物乳桿菌()內最穩定的內參基因組合為、、和這一結果的正確性。隨著對實驗精度要求的提高，篩選合適的內參基因，并進行準確性驗證將會成為實驗步驟中必不可少的一部分。

研究表明，不同物種、不同組織、不同發育階段以及不同環境條件均會影響內參基因的表達。在真核生物基因檢測中，常使用、、、等作為內參基因(Suzuki, 2000; 薛蓓等, 2017)，但也有學者發現，(Selvey, 2001)和(Deindl, 2002)并不是最穩定的內參基因。Radonic等(2004)研究證明，人體各組織最適內參基因也不是傳統意義上的，而是RPⅡ。在原核生物內參基因篩選中，內參基因的穩定性也隨著環境的變化而變化。如Yang等(2018)發現勞爾氏菌()在生物(生長階段)和非生物(溫度、羥基香豆素、營養) 4種脅迫處理下，7個內參基因所表現出的穩定性差異顯著，在不同的生長階段中，和是最穩定的內參基因，而在溫度脅迫下，、和最為穩定；在羥基香豆素脅迫下，、和最為穩定；而在營養脅迫下，和最穩定。因此，在特定的研究背景下，需對生物的內參基因進行重新評判，以增加基因檢測的穩定性和可靠性。目前，常用于副溶血弧菌基因檢測的內參基因有、、、、、(Ma, 2015; Coutard, 2007; Li, 2013; 李沁, 2013)。Ma等(2015)將5株不同來源的副溶血弧菌培養于4種溫度下，篩選出不同溫度下副溶血弧菌最適內參基因為。李沁(2013)以5株攜帶不同毒力基因的副溶血弧菌為研究對象，選取海水、過濾海水以及凡納濱對蝦作為培養介質，篩選出最適內參基因為和。結果表明，是不穩定的內參基因。但本研究結果顯示，為最穩定的內參基因，這與他們的研究結果不同。Hengge-Aronis(2002)研究表明，低溫與高溫能分別影響Rop S蛋白的翻譯與水解過程，因此，溫度的變化會顯著影響Rop S的調控機制，造成其不穩定表達。李沁(2013)選取的副溶血弧菌樣品來源差異顯著，本身并不具備相同生理條件，因而表達不夠穩定。中草藥中所蘊含的活性成分多為不具藥理作用活性物質前體，且不同種類的中草藥之間差異很大，其藥效發揮的機制十分復雜(吳秋云等, 2018)，對細菌的作用機理不能簡單地等同于環境因子脅迫，因而表達穩定性出現了不同的結果。

本研究結果可用于地榆醇提物對VPAHPND相關基因表達量變化的探究，為以地榆為核心藥物防控AHPND技術的開發做鋪墊。這個現象進一步說明內參基因使用前確實需要針對實驗條件進行穩定性篩選和驗證，才能保證后期研究結果的可靠性。

3.3 內參基因豐度對其穩定性評價的影響

基因的表達豐度(C值)是篩選最適內參基因時的重要選擇依據，C值過大或過小會使qRT-PCR數據分析時很難準確地減去基線值(Vandesompele, 2002)。Wan等(2011)指出，適宜作為內參基因的理想C值范圍是15~30。本研究使用的是Ma等(2015)設計的引物，實驗中的C值范圍為8.14~9.93。本研究中，在副溶血弧菌遭受各種濃度地榆醇提物的脅迫下，仍表現出較強的穩定性，但其在副溶血弧菌細胞內表達的C值在4.32~5.16之間，表達豐度過高，不適宜作為內參基因。這兩項研究檢測到的副溶血弧菌的C值范圍存在極顯著差異，可能是菌株差異或者是培養環境不同所引起的。作者所使用的副溶血弧菌(VPAHPND)為能引起凡納濱對蝦AHPND的臨床分離株，與Ma等(2015)使用的菌株存在時間、地域和環境差異。Radonic等(2004)也指出，轉錄是通過RNA聚合酶Ⅰ進行的，不適于作為內參基因。本研究使用的其他5種候選內參基因的平均C值均介于內參基因的理想C值范圍內(15<C<30)，可作為候選內參基因。

3.4 最適內參基因數量分析

在基因表達檢測過程中，如果實驗精度要求較高，可通過計算配對變異系數確定最適內參基因數量，來減小單一內參基因引起的誤差。Vandesompele等(2002)提出通過配對變異系數評價最適內參基因個數的方法，即首先計算2個最穩定的內參基因在所有樣品中的標準化因子(NF2)，然后，逐步引入其他內參基因，計算標準化因子(NF)，直至第+1內參的引入對NF+1無顯著影響時停止引入。接著計算配對變異系數(V/V+1)，來反映新引入的內參基因對NF+1影響。Vandesompele等(2002)建議將V/(n+1)=0.15作為一個參考值，當V/(n+1)>0.15時，則有必要引入第+1個基因，而V/(n+1)<0.15時，則表明該實驗條件下最適內參基因個數為。本研究得出2/3=0.077，即選擇的最適內參基因個數為2。綜合以上結果，本研究僅篩選和作為該條件下最穩定的內參基因。

4 結論

本研究就地榆醇提物脅迫下VPAHPND生長變化和該條件下VPAHPND中6種常見內參基因(、、、、和)的穩定性進行評價。結果驗證了地榆對VPAHPND的抑制效果，并推薦和作為該條件下內參基因，其效果會優于只使用單一的內參基因。這為以地榆為核心藥物的AHPND防控技術的建立和從基因表達角度研究地榆對VPAHPND的作用機理提供了基礎，同時，也為中草藥藥理作用的深入挖掘提供了研究思路。

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Effects on the Growth of Shrimp Pathogen VPAHPNDand Selection of Suitable Reference Genes Under Different Concentrations ofL. Alcoholic Extracts

YANG Zeyu1,2, LIAO Meijie2,3①, WANG Yingeng2,3, ZHANG Zheng2,3, WEI Xinxian4, LI Bin2,3, RONG Xiaojun2,3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 4.Guangxi Academy of Fishery Science, Nanning 530021)

The identification of reference genes is critical for the establishment of sensitive and reproducible qRT-PCR-based assays. The current study was designed to explore the effects on acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)-causingstrains (VPAHPND) on the growth of shrimp in the presence of different concentrations ofL. alcoholic extracts and to select the optimal reference genes suitable for the evaluation of the inhibitory effect ofL. on VPAHPND. The expression of six common candidate reference genes (,,,,, and) of VPAHPNDunder stress induced byL. alcoholic extracts were detected by qRT-PCR. Data analysis was conducted using the GeNorm, Norm Finder, Best Keeper, Delta CT, and Ref Finder software packages. The results showed thatL. alcoholic extracts had a strong inhibitory effect on. The amplicons of these six genes had good specificity under the stress induced by different concentrations ofL. extract. The lowest variation invalue was found for(CV=3.88), and the highest variation occurred in(CV=12.53). The stability of the six reference genes judged by the five methods was as follows: The stability order results were:=>>>>from GeNorm;>>>>>from Norm Finder;>>>>>from Best Keeper; and>>>>>from DeltaC. The comprehensive ranking result from by Ref Finder was>>>>>. After consideration of the pairwise variations, it is recommended to use bothandas reference genes in these conditions. It was also revealed that the stability of reference genes differed between different strains and under different experimental conditions. With the improved experimental accuracy requirements, screening and verification of the appropriate reference gene has become an essential part of the experimental methodology. The results provide a foundation to support the study of the inhibitory mechanism ofL. on VPAHPNDthrough the perspective of gene expression. It is of great significance for the establishment of AHPND-prevention technology usingL. as the core drug.

Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND);;L.; Reference genes; qRT-PCR

廖梅杰，副研究員，E-mail: liaomj@ysfri.ac.cn

2019-02-15,

2019-03-28

S966.9

A

2095-9869(2020)02-0150-09

* 廣西科技重大專項(桂科AA17204081-4)、農業農村部農業國際合作交流項目—“一帶一路”熱帶國家水產養殖科技創新合作和中國水產科學研究院黃海水產研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項基金(20603022017004)共同資助 [This work was supported by Special Science and Technology Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region (Guike AA17204081-4), Projects of International Exchange and Cooperation in Agriculture, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, China-Science, Technology and Innovation Cooperation in Aquaculture with Tropical Countries, and Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022017004)]. 楊澤禹，E-mail: 15705274036@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190215001

http://www.yykxjz.cn/

楊澤禹, 廖梅杰, 王印庚, 張正, 韋信賢, 李彬, 榮小軍. 地榆醇提物對對蝦致病菌VPAHPND生長影響及最適內參基因的篩選. 漁業科學進展, 2020, 41(2): 150–158

Yang ZY, Liao MJ, Wang YG, Zhang Z, Wei XX, Li B, Rong XJ. Effects on the growth of shrimp pathogen VPAHPNDand selection of suitable reference genes under different concentrations ofL. alcoholic extracts. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 150–158

LIAO Meijie, E-mail: liaomj@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)