典型黑土環境下的高、低鎘積累白菜品種篩選及耐性比較

陳 辰，朱園辰，喇樂鵬，張思佳，丁工堯，閆 雷

（東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

近年來，由于設施農業的不合理開展以及工業化程度的逐步加深[1]，致使農業土壤鎘（Cd）污染問題日趨嚴重，許多農用地無法安全利用[2]。據全國土壤污染調查公報顯示[3]，我國土壤中Cd的點位超標率為7.0%，農田Cd污染面積高達2×104hm2，已被確定為全國土壤污染首要污染物，而國務院頒布《土壤污染防治行動計劃》中要求：到2020年，我國污染地塊安全利用率需達到90%以上，因此Cd污染區農用土壤的安全利用已迫在眉睫[4]。Cd在農業環境中具有極高的生物累積性、毒性、環境移動性及持久性。因而極易危害土壤-植物系統，繼而威脅食品安全及人類健康。據不完全統計，我國每年生產的Cd含量超標的農產品達“1.46×106t，且呈逐年增長趨勢[5]。

有研究表明，因地制宜地開展農作物高、低積累品種篩選可使輕度Cd污染農用地得到安全有效的利用，如污灌區小麥品種篩選[6]及高Cd積累水稻品種篩選[7]等，現均已證實其應用可行性。高、低積累作物品種的篩選工作我國早有開展[8]，受試品種應具備優秀環境適應能力和穩定傳代的積累特征[9]。葉菜類蔬菜種類多樣，品種豐富，在我國廣泛栽培。目前已知不同種類、不同品種葉菜類蔬菜對重金屬脅迫存在明顯不同的抗性和積累，如大白菜[10]、青菜[11]和菠菜[12]等蔬菜對重金屬的吸收與積累存在物種、品種和同一作物不同器官間的顯著差異，而普遍的葉菜類蔬菜特別是白菜（Brassica pekinensis L.）品種更易吸收Cd并受其影響[12]。因此，Cd耐受力強，明確積累能力的白菜品種更應適宜在輕度污染的中國北方推廣。然而，黑土中較高的有機質和pH雖然能夠限制Cd在環境中的遷移能力，但局域性積累卻已然威脅到了食品安全[13]。由于黑土的這一特點，Cd在其中的威脅性常受忽視，目前尚缺乏針對北方典型黑土Cd污染環境中高、低Cd積累葉菜類蔬菜的研究。故本研究通過盆栽試驗模擬典型黑土區溫室栽培條件，針對20種東北地區主栽白菜品種的Cd耐受力及積累特征進行篩選。以期為輕度Cd污染農用地的安全利用及黑土資源保護提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤類型系典型黑土，于2018年5月取自東北農業大學向陽實驗基地試驗溫室區（44°04'N，125°42'E）0～20 cm耕層，過2 mm篩除去礫石等雜質，裝袋、烘干、殺菌備用。同時取少量土壤用于土壤常規分析[14]及Cd含量測定[15]，其土壤理化性質見表1。

1.2 試驗設計

本試驗于2018年5—8月在東北農業大學向陽實驗基地溫室區10號大棚內進行。為保證各處理間養分含量相同且滿足植物生長需要，預先向供試土壤施入尿素、磷酸氫鈣和氯化鉀作為底肥（N：100 mg·kg-1、P：120 mg·kg-1、K：350 mg·kg-1），使各處理養分水平一致。供試土壤裝于聚乙烯塑料盆（20 cm×15 cm×5 cm），每盆裝土1.5 kg。共設7組Cd處理：0、0.05、0.1、0.15、0.3、0.6、1.2 mg·kg-1，向土壤中噴施外源Cd溶液（CdCl2·2.5H2O），待其風干后攤開混勻以加速其均質化進程，均質期40 d，期滿后播種。供試品種信息見表2。

將供試白菜種子用10%H2O2消毒15 min，后用去離子水沖凈，挑選籽粒飽滿的種子播種，每盆播種20粒，待植株長至3片真葉時，間苗至每盆6株，期間將土壤含水量保持在田間持水量的65%～70%，及時去除蟲害、雜草（整個栽培過程仿照當地習慣栽培模式進行）。每品種、每處理均重復3次，種植30 d后取每品種、每處理長勢一致的3株用于Cd劑量-效應分析，40 d后收獲余下植株進行Cd積累量及氧化損傷等指標測定，收獲時先用自來水將完整的白菜植株沖洗干凈，再用EDTA-2Na浸泡植株根系30 min，以去除根系表面有效態Cd，并經去離子水沖洗后用吸水紙擦干，將白菜分為根和可食用部分（葉）分置于-80°C冰箱保存。

1.3 指標測定

收獲的白菜樣品清理完畢后直接稱質量，生物量以鮮質量計。土壤樣品處置及Cd含量測定參照《土壤質量鉛、鎘的測定石墨爐原子吸收分光光度法》（GB/T 17141—1997）[15]，植物根際土壤樣品以抖落法收集500 g，四分法縮分至100 g風干，過2 mm篩除去礫石等雜質，研磨使其全部通過0.15 mm篩備用，其中5 g用于水分含量f的測定，另取待測土樣0.2 g采用濕式消解法處理，利用石墨爐原子吸收分光光度計（Persee General，TAS-GF 990 super，中國）測定 Cd 含量WCd，其中 f及 WCd按下式計算：

表1 供試土壤理化性質Table 1 Physical and chemical properties of the tested soil

表2 供試白菜編號、品種及原產地Table 2 The code，cultivar and origin of the tested cabbages

式中：f為土壤水分含量，%；W1為烘干前土壤質量，g；W2為烘干后土壤質量，g；WCd為土壤Cd含量，mg·kg-1；c為試液吸光度減去空白試驗的吸光度，然后在校準曲線上查得Cd的含量，μg·L-1；V為試液定容體積，mL；m為稱取試樣質量，g。

植物樣品Cd含量測定參照《食品安全國家標準食品中鎘的測定》（GB 5009.15—2014）[16]，植物各部分樣品稱質量后冷凍研磨，取0.50 g經濕式消解法處理，消解完成用1%HNO3定容至25 mL容量瓶中并做試劑空白，試液經12 000 r·min-1離心10 min后取20 μL上清液于石墨爐原子吸收分光光度計進行測定，同時以國家標準物質（GSB 04-1721—2004 188038-4，GBW 08502）進行分析質量控制，所有植物樣品Cd回收率均大于95%。按下列公式計算白菜可食用部分（葉）及根中Cd含量W、植株相對生物量RFBs、可食用部分（葉）富集系數BCFs、遷移系數TFs及全株凈化率ERs：

式中：W為植物樣品Cd含量，mg·kg-1；c1為試樣消化液Cd含量，ng·mL-1；c0為空白液 Cd含量，ng·mL-1；V為消化液定容總體積，mL；m為稱取試樣質量，g；bT為處理組生物量，g；bCK為對照組生物量，g；WLeaf為可食用部分 Cd 含量，mg·kg-1；WRoot為根部 Cd含量，mg·kg-1；b1為可食用部分鮮質量，g；b2為根部鮮質量，g；ms為根際土壤總質量，g。

白菜葉中的氧化損傷通過單位葉片鮮質量的過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2）、丙二醛（MDA）、游離脯氨酸（FPRO）含量來評估，均需取0.5 g新鮮、清潔的葉片樣品，在冷凍條件下制備成勻漿待測。過氧化氫含量測定采用硫酸鈦-可見分光光度法[17]，超氧陰離子含量測定采用鹽酸羥胺-可見分光光度法[18]，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）-可見分光光度法[19]，游離脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮-可見分光光度法[20]。

1.4 數據處理及分析

1.4.1 白菜品種Cd劑量效應分析

有研究表明[21]，邏輯斯蒂分布模型（Log-logistic distribution）可較好地擬合重金屬對植物的劑量-效應關系，由此推知諸如植物的半數有效量（ED50）等劑量參數，且適用于單一物種的生物敏感性分布（Species sensitivity distributions，SSD），故本研究采用其對不同品種白菜鎘脅迫劑量-效應曲線進行擬合，并對擬合結果進行外推，以評估供試白菜品種的Cd耐受力。Log-logistic模型如下：

式中：y為各Cd處理水平白菜相對生物量，%；a、k為擬合參數；x為各個Cd處理的濃度值，mg·kg-1；xc為EC50的自然對數值。

1.4.2 數據處理

采用Excel 2016進行數據處理，Origin 2018軟件進行繪圖，應用SPSS23.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和P＜0.05水平下的LSD檢驗、Tamhane檢驗。

2 結果與討論

2.1 不同品種白菜Cd脅迫劑量-效應

圖1 不同品種白菜Cd脅迫-劑量效應曲線Figure 1 Dose-effect curves of different cabbage cultivars under Cd stress

不同品種會因Cd劑量不同而產生生物效應上的差異。就白菜而言最直觀的劑量-效應便是生物量的變化。如圖1，低Cd濃度下（0.05 mg·kg-1），除品種4、6、11、12、16、17、20外的13種白菜生長均表現出一定毒性刺激（Hormesis）效應，較對照生物量增幅0.57%～4.51%，這與Sidhu等[22]研究中發現低濃度Cd促使臭薺（Coronopus didymus L.）生物量增加的情況相似，這或許是植物在低Cd脅迫時的一種保護性“稀釋”機制；而隨濃度上升，各品種相對生物量均開始降低，此時Cd的毒性抑制對白菜生長產生影響；而土壤Cd濃度達到最大（1.2 mg·kg-1）時，Cd生物量抑制作用最明顯。通過劑量效應曲線，可求算出供試白菜Cd的EC50及其95%置信區間，如表3。Cd脅迫下20種白菜EC50的變化范圍為 0.469～1.204 mg·kg-1，且 r2最低為0.983，優于Wang等[23]以印度芥菜亞細胞積累表征的研究結果。其中品種18（JF）EC50值最高，為1.204 mg·kg-1；品種20（QT）EC50值最低，為 0.469 mg·kg-1，二者相差2.57倍。

由于盆栽試驗環境較為恒定，可排除多數干擾因素，如pH、鹽效應等的干擾，因此可通過Log-logistic模型擬合白菜品種生物量，衡量不同品種Cd耐受能力[24]。基于不同品種白菜生物量進行擬合的半數抑制濃度結果可知，黑土栽培過程中供試白菜Cd耐受能力 由 高到 低 依 次 為：JF、BCCRQJ、XF、HX65、XFQB、DHF65、586LSKF2、JYKC、SK、JYKC4、ZB61、FGKC、DN909、CRDW3、JQFSS、JBC、GLDB、DC18J、FGC80F1、QT，品種Cd耐性差異明顯，將半數抑制濃度進行對數變換后，繼續采用Log-logistic模型對其進行物種敏感性分析（SSD），分布曲線如圖2，基于半數抑制濃度的擬合結果較好，r2=0.982 1，大部分品種的實際值大于或接近預測值，但耐性最佳品種JF和最差品種QT有較高預測值，這同Ding等[25]在白菜-土壤系統上建立SSD以評價土壤Cd閾值的結果類似，或許說明其可能在其他環境下具備較高耐Cd潛力。

表3 白菜Cd半抑制毒性閾值濃度（EC50，mg·kg-1）及其95%置信區間Table 3 Toxicity thresholdsof Cd to cabbage cultivars（EC50，mg·kg-1）and their 95%confidence intervals

2.2 不同白菜品種的Cd積累特征分析

圖2 不同白菜品種基于半數抑制濃度的物種敏感性分布曲線Figure 2 Cumulative frequencies of species sensitivity distributions（SSD）of thedifferent cabbagecultivarsbased on EC50

土壤中Cd污染程度不同會造成白菜的積累差異，而白菜可食部分（葉）中的Cd積累是評定其食用安全性的重要參數[10]。不同程度Cd污染土壤中供試品種葉積累量分布如圖3，對于同一程度Cd污染，20種白菜品種葉中Cd積累量符合正態分布，品種間差異明顯，按Cd積累量離散程度由小到大分別為0.1、0.05、0.15、0.3、0.6、1.2 mg·kg-1，其中 Cd投加濃度為0.6 mg·kg-1和1.2 mg·kg-1的土壤中有過半數的供試品種超過或接近《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中葉菜類農產品Cd檢出限0.2 mg·kg-1[26]，而其他投加濃度下葉Cd積累量較小，難以作為特征積累品種的篩選依據，且0.6 mg·kg-1和1.2 mg·kg-1的土壤Cd添加濃度為《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）中[27]推薦農用地土壤Cd污染風險篩選值（0.6 mg·kg-1，pH＞7.5）的1倍和2倍，可供指導實際篩選工作。因此，為準確切合東北典型黑土耕作環境，篩選出安全可靠的白菜品種，本試驗確定以土壤Cd投加濃度0.6 mg·kg-1和1.2 mg·kg-1作為篩選濃度，測定供試品種各部位Cd積累量，以鑒定高、低Cd積累白菜品種。

圖3 不同程度Cd污染土壤中白菜品種的積累量范圍Figure 3 Accumlation range of cabbage cultivars in soil of different Cd level

白菜品種間各部位Cd積累能力也存在差異，而不同部位Cd積累量差異決定了品種獨特的積累特征和植物-土壤效應[28]，供試白菜各部分Cd積累量如圖4，當土壤外源Cd含量為1.2 mg·kg-1時（圖4A），葉Cd積累最高品種為DHF65（品種15），積累量達1.348 mg·kg-1FW；最低為JF（品種18），積累量僅0.106 mg·kg-1FW，也是試驗中唯一一種在1.2 mg·kg-1篩選濃度下Cd積累量低于0.2 mg·kg-1FW國家食品安全標準限值的供試品種。根Cd積累最高品種為BCCRQJ（品種13），積累量達3.128 mg·kg-1FW；最低品種為JF（品種18），積累量為0.614 mg·kg-1FW。大部分葉菜類蔬菜葉Cd積累均保持較高水平，這與張澤錦等[29]的研究相似。而當土壤外源Cd含量為0.6 mg·kg-1時（圖4B），葉Cd積累從高到低依次為品種1、5、15、7、3、10、2、9、14、6、4、13、12、8、19、16、17、20、11、18，其中30%超出了國家食品安全標準限值。根Cd積累由高到低依次為品種10、5、1、15、7、9、13、8、3、2、14、20、19、6、4、12、18、16、11、17。由于篩選濃度已經接近或降至品種的耐受濃度，同高濃度組相比，一些品種（如FGC80F1）的Cd積累量有了較大變化，相關研究認為[30]這是由于植物根系在Cd積累中起著主控作用。

圖4 供試白菜品種不同部位Cd積累量Figure 4 Cd accumulation in different parts of tested cabbage cultivars

植物Cd積累特征可通過富集系數（BCFs）、遷移系數（TFs）來描述，而根際土壤Cd含量和植物凈化率可反映植物-土壤體系中的相互作用，有助于選取適當植物控制土壤污染[31]。供試品種根際土壤Cd含量、富集系數、遷移系數、凈化率如表4，1.2 mg·kg-1篩選濃度下，品種間根際土壤Cd含量差異明顯（P＜0.05），CRDW3（品種1）具有最強的葉Cd富集能力，是最弱品種QT（品種20）的10.8倍，FGC80F1（品種17）根葉間Cd遷移最強，為最弱品種JF（品種18）和QT（品種20）的5.0倍，BCCRQJ（品種13）單株凈化能力最佳，是最低品種XFQB（品種19）的11.7倍；0.6 mg·kg-1篩選濃度下的品種間根際土壤Cd含量差異也十分明顯（P＜0.05），但品種積累特征并不同于高濃度（1.2 mg·kg-1），BCCRQJ（品種13）葉Cd富集能力最高，是最低品種JF（品種18）的5.7倍，JYKC（品種6）根葉間Cd遷移能力最高，為最低品種JF（品種18）的4.2倍，BCCRQJ（品種13）在0.6 mg·kg-1篩選濃度下也具有最高Cd凈化率，為14.28%，最低的QT（品種20）與之相差5.6倍。相關研究認為[32]低積累植物可食用部分遷移系數和富集系數應小于1，且系數越小越說明污染物難向可食用部分積累，而高積累植物遷移系數和富集系數則越大越好，也有學者[33]發現青葙（Celosia argentea Linn.）等Cd超積累植物葉積累能力高于根系。不僅如此高積累植物更看重對污染物的凈化率，凈化率越高，單株凈化能力越強，吳志超[34]也據此完成對高、低Cd積累油菜的篩選。

2.3 高、低Cd積累品種的濃度積累效應

可投入實際生產的高、低Cd積累品種需具備耐受力強，積累特征穩定且顯著的特點，而其積累量也與生物量存在聯系[35]。由于95%的供試品種在1.2 mg·kg-1篩選下生長不良，僅JF在此濃度下有較高生物量，結合各品種半數抑制濃度（表3），BCCRQJ（品種13）Cd耐受力僅次于JF，且凈化率最高，僅根部積累量就達3.128 mg·kg-1FW，可作為高Cd積累品種適用于≤0.6 mg·kg-1Cd污染地區，而JF（品種18）葉Cd積累量低，Cd富集、遷移因子均小于1，0.6 mg·kg-1篩選條件下JF葉僅含Cd 0.031 mg·kg-1FW，可保證食用安全，可作為低Cd積累品種應用于≤0.6 mg·kg-1Cd污染地區。對比二者隨土壤外源Cd含量變化的積累能力發現（表5），兩品種葉、根的Cd積累量均顯著增高（P＜0.05），其中BCCRQJ（品種13）葉、根積累量在1.2 mg·kg-1下最高，分別為JF的4.8倍和5.1倍。而對比二者凈化率可發現（表5），土壤外源Cd濃度增加會降低兩品種凈化效率，但即使在高濃度下（1.2 mg·kg-1），BCCRQJ凈化率也高于唐皓等[7]研究中高Cd積累品種的凈化率。低濃度下（0.15 mg·kg-1）BCCRQJ凈化率有所升高，這可能是由于低濃度Cd刺激了BCCRQJ的吸收與體內輸送[36]。不過，雖然BCCRQJ有較高單株凈化率，但積累量較低，遠不及龍葵[37]等超積累植物的凈化能力。

表4 供試白菜品種根際土Cd含量、富集系數、遷移系數及凈化率Table 4 Cd content in rhizosphere，bioconcentration factors（BCFs），translocation factors（TFs），and extraction rates（ERs）of tested cabbage cultivars

2.4 Cd脅迫下兩種白菜的氧化損傷

Cd脅迫會導致白菜積累過氧化氫、超氧陰離子等活性氧（ROS），造成氧化損傷產生大量丙二醛和游離脯氨酸[35]，且氧化損傷的程度受Cd濃度影響[38]。Cd誘導不同品種白菜產生的氧化應激反應與基因型有關，不同外源Cd濃度下，兩白菜品種葉中的過氧化氫、超氧陰離子、丙二醛及游離脯氨酸含量如圖5所示。

正常植物體內過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2）等活性氧的產生和清除維持著動態平衡，Cd脅迫會打破該平衡，致使其瞬時積累繼而氧化損傷細胞膜結構，其含量是表征植物氧化損傷程度的重要指標，如圖5A、圖5B。外源Cd含量與兩種白菜葉中H2O2含量及O-2含量均呈顯著正相關（P＜0.05），但BCCRQJ中H2O2增長率高于JF，而O-2增長率則低于JF：當土壤中Cd濃度達到1.2 mg·kg-1時，BCCRQJ的H2O2含量較對照（0 mg·kg-1）增長了94.2%，而JF增長了38.7%；BCCRQJ的O-2含量較對照增長了200.2%，而JF增長了217.8%。當植物遭受Cd脅迫，O-2的動態平衡會率先被打破，大量O-2的積累會加速細胞衰亡，而H2O2作為植物自身O-2清除反應的中間體，也會大量積累[39]。當低濃度Cd（0.15 mg·kg-1）脅迫JF時，其H2O2含量有所降低，這可能是由于JF自身抗氧化能力提高所致，這同Singh等[40]對于Cd脅迫番茄幼苗的研究結果類似。

表5 不同濃度外源Cd脅迫下兩種白菜的Cd積累Table 5 Accumulation of two cabbage cultivars under different exogenous Cd concentrations

圖5 不同濃度外源Cd脅迫下兩種白菜氧化損傷指標Figure 5 Oxidative damage factors of two cabbage cultivars under different exogenous Cd concentrations

丙二醛是脂質過氧化的重要產物，而游離脯氨酸通常伴隨植物鹽脅迫而激增，正常狀況下含量極低，二者均可作為評價Cd誘導植物產生氧化損傷程度的重要指標[41]，如圖5C和圖5D。兩白菜品種MDA、FPRO含量均隨土壤Cd含量升高而顯著增高（P＜0.05），同對照相比，1.2 mg·kg-1土壤Cd濃度下，BCCRQJ的MDA含量增長了124.1%，FPRO含量增長了284.9%，JF則分別增長了114.4%和186.4%。Mzoughi等[42]也將MDA作為反映植物Cd誘導氧化損傷程度的指標，發現了Cd脅迫菠菜組織MDA大量積累；同樣Ozfidan-Konakci等[43]認為FPRO含量增加可視作脅迫發生標志，觀察到Cd處理7 d小麥幼苗中FPRO含量顯著升高。另外，當外源Cd增至最高（1.2 mg·kg-1），BCCRQJ中 H2O2、O-2、MDA、及FPRO含量水平均高于JF，除O-2外，BCCRQJ各指標增幅也高于JF，孫園園等[44]對于高Cd積累植物黑麥草的研究中也發現，隨Cd含量升高脯氨酸、MDA含量有所上升，細胞質、膜過氧化明顯。這意味著在較高的污染水平下高Cd積累白菜品種或許會比低Cd積累白菜品種承受更嚴重的氧化脅迫。

3 結論

（1）20種白菜對于Cd脅迫的敏感性分布具有顯著差異，其中JF具有最強Cd耐性，耐受閾值為1.204 mg·kg-1，BCCRQJ次之，為1.036 mg·kg-1，QT Cd耐性最差，僅為0.469 mg·kg-1。

（2）不同土壤Cd濃度下20種白菜可食用部分積累量差異均明顯，其中土壤外源Cd含量為1.2 mg·kg-1時種間差異最大，0.6 mg·kg-1時次之。此兩濃度下：JF可食用部分Cd積累量均最低，低于國家食品安全標準限值0.2 mg·kg-1（葉菜類產品）；遷移、富集系數均小于1，說明其可作為在東北地區安全生產的低Cd積累品種。而BCCRQJ凈化率最高，為18.64%，說明其有較好Cd吸收作用，為高Cd積累品種，具有一定植物修復潛力。

（3）JF和BCCRQJ葉、根Cd積累量與土壤Cd含量呈顯著正相關，凈化率與之顯著負相關（P＜0.05）。且隨Cd脅迫程度加劇，二者氧化損傷越嚴重，過氧化氫、超氧陰離子、丙二醛、游離脯氨酸含量均隨土壤外源Cd含量上升而顯著增加（P＜0.05），但BCCRQT除超氧陰離子外的氧化損傷指標增幅均高于JF，說明高Cd積累品種能承受更高的氧化損傷風險，而低積累Cd品種JF能更好地抵抗Cd誘導的氧化脅迫。