菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻種子萌發的影響

趙澤文，楊政寧，萬 琳，程 新

（江西省農業微生物資源開發與利用工程實驗室/江西農業大學生物科學與工程學院，南昌 330045）

銅是植物生長的必需元素，但超量的銅元素會對植物生長、呼吸、光合等生理過程產生明顯的抑制作用，進而影響作物的生長與產量[1]，并嚴重威脅農產品的質量安全[2-3]。近年來，隨著工農業生產的快速發展，銅礦的過度開采、工業“三廢”的排放以及含銅殺菌劑和化肥等在農業生產過程中的頻繁使用造成了土壤中銅元素的大量累積，銅污染已成為嚴重的土壤環境污染問題之一[4]。

目前，對銅污染的生態恢復研究，主要通過物理與化學技術、生物技術及農業生態技術進行污染綜合治理和生態修復[5]，但是這些方法也面臨投資昂貴、所需設備復雜、時間長久等問題。已有大量研究表明，通過添加外源物質檸檬酸[6]、硫硅配施[7]、水楊酸[8]、油菜素內酯[9]等可以提高作物對銅污染的耐受性。這種方法投入成本低，對土壤環境干擾破壞小，因此在治理銅污染土壤方面具有廣闊的應用前景。

江西是銅礦大省，銅產量位居全國榜首[10]，但過度的開采和廢物的排放也造成了嚴重的土壤環境污染[11]，大量研究表明在銅礦開采區域，土壤、水體中的銅元素顯著超標，給水稻等作物的安全生產造成了很大的影響。有研究表明，多糖具有一定的抗氧化能力和提高生物活性能力，同時其含有大量功能基團可以吸附環境中的重金屬，在應對農業重金屬污染方面具有廣闊的前景，但相關研究國內外尚未見報道。因此，本研究以茶樹菇菌糠多糖為試驗材料，研究其對銅離子脅迫下水稻種子萌發的影響，并通過形態學觀察、酶活測定等方法初步闡明茶樹菇菌糠多糖誘導水稻緩解銅離子毒害的作用機理，為外源天然物質應用于重金屬污染區域農作物生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

五優308水稻種子由湖南隆平種業有限公司提供，種子經84消毒液（稀釋200倍）浸泡15 min，然后用蒸餾水沖洗4～6次至無消毒液氣味，備用。

茶樹菇菌糠由撫州市黎川縣江西利康綠色農業有限公司提供，經烘干、粉碎、過篩、熱水浸提、濃縮、乙醇浸提、凍干得到茶樹菇菌糠多糖[12]。

1.2 試驗設計

1.2.1 不同銅離子濃度溶液對水稻種子處理

消毒后的種子用蒸餾水浸泡1 d，挑選顆粒飽滿的種子鋪在含兩層濾紙的平皿上，每皿100粒，用不同濃度的銅離子溶液0（CK）、2、4、6、8、10 mg·L-1浸泡，設置3次重復。培養皿放置于28℃培養箱進行黑暗處理，每2 d換1次培養液，培養至第8 d收集備用。

1.2.2 銅離子脅迫下茶樹菇菌糠多糖對水稻種子處理

設茶樹菇菌糠多糖濃度分別為 0、1、10、100、1000、2000 mg·L-1。將浸泡消毒后的水稻種子分別放入不同濃度的茶樹菇菌糠多糖溶液中，于室溫下浸種24 h，鋪在含兩層濾紙的平皿上，每皿100粒，用6 mg·L-1的銅離子溶液浸泡，以無脅迫處理為對照組（CK），設置3次重復。培養皿放置于28℃培養箱進行黑暗處理，每2 d換1次培養液，培養至第8 d收集備用。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 形態指標的測定

培養期間每日記錄水稻種子萌發數量，第3 d統計種子發芽勢，第8 d統計種子發芽率并測定水稻幼苗的根長、芽長、根鮮質量和芽鮮質量。按照下列公式計算發芽勢和發芽率：

發芽勢=3 d內發芽種子數/供試種子數×100%

發芽率=8 d內發芽種子數/供試種子數×100%

1.3.2 生理指標的測定

銅離子吸收量的測定[13]：取水稻根系浸入25 mmol·L-1EDTA-Na溶液中交換15 min，以解吸根系表面吸附的金屬離子，再用去離子水沖洗并用濾紙吸干水分，然后分別于105℃殺青2 h，75℃烘干至恒質量，采用HNO3-HClO4（4∶1，V∶V）消化后用原子吸收光譜儀測定銅含量。

質膜透性的測定[14]：分別剪取大小和部位相同的水稻幼芽和根，先用蒸餾水洗凈，再用去離子水沖洗，然后用濾紙吸干表面水分，將幼芽和根剪成長度適宜的長條，測定相對電導率。

質膜完整性的測定[15]：質膜完整性檢驗采用Evans blue染色的方法。從銅離子脅迫后的培養皿里取長度為2 cm左右的水稻幼苗根尖，每個濃度3～5根，放于4℃冷處理的0.5 mmol·L-1CaCl2（pH 4.5）溶液中浸泡5 min，然后用蒸餾水洗凈吸干，再將根浸泡于4 mL 0.025%伊文思藍溶液（伊文思藍溶于100μmol·L-1pH 5.6的CaCl2溶液）中30 min，取出后用蒸餾水沖洗，再在蒸餾水中浸泡15 min，最后在光學顯微鏡下觀察拍照，以測定原生質膜的完整性。

可溶性蛋白和糖的測定[16]：稱取0.5 g水稻幼芽置于研缽中，加入pH 5.6的檸檬酸緩沖液，磨成勻漿后倒入10 mL離心管中，用緩沖液定容至刻度，混勻后在20℃下放置15～20 min，期間每隔3 min振蕩一次。然后經4 ℃、4000 r·min-1離心15 min，取上清液備用。采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白，采用硫酸-蒽酮法測定可溶性糖。

MDA含量的測定：采用硫代巴比妥酸（TBA）法[17]測定MDA含量。取幼芽0.5 g，與10 mL 10%的三氯乙酸和少量石英砂在冰浴中研磨成勻漿，4℃、4000 r·min-1離心10 min，上清液即為提取液，于4℃保存，用于MDA含量的測定。

抗氧化酶活性的測定[18]：稱取幼芽0.5 g于預冷的研缽中，加入5 mL預冷的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.8，2%聚乙烯吡咯烷酮PVP）及少量石英砂，冰浴研磨成漿，4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液，用緩沖液定容至10 mL。采用雙氧水法測定過氧化氫酶（CAT）活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用氮藍四唑（NBT）比色法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.4 數據處理

采用Origin 8.5、DPS 7.5軟件進行統計分析和差異顯著性檢驗，對不同處理的數據進行單因素方差分析和Duncan多重比較。表中數值均為平均值±標準差，圖、表中不同小寫字母表示不同處理間在α=0.05水平上差異顯著，表示差異顯著性的字母按照從大到小的順序標記，即最大平均數標記為a。

2 結果與分析

2.1 不同濃度銅離子對水稻種子萌發及生理特性的影響

2.1.1 對水稻種子萌發的影響

由表1可知，銅處理對水稻種子的發芽勢、發芽率和根長均有顯著的抑制效果。隨著銅離子濃度的增加，抑制效果也增加，當銅離子濃度為10 mg·L-1時，對水稻種子的發芽勢、發芽率和根長的抑制率分別達到了53.08%、33.79%、65.39%。

2.1.2 對水稻種子銅離子吸收量和質膜透性的影響

從表2的結果可以看出，隨著銅離子濃度的不斷增加，根和芽的銅離子濃度都呈先上升后下降的趨勢，當銅離子濃度為6 mg·L-1時，根的吸收量最大；當銅離子濃度為8 mg·L-1時，芽的吸收量最大。由于根和芽的銅離子吸收量增大，導致根和芽的質膜透性受損，相對電導率增大（表2）。

2.1.3 對水稻種子MDA含量及抗氧化酶活性的影響

MDA是膜脂過氧化的最終分解產物，是植物細胞膜質過氧化程度的體現，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。由表3可知，銅離子添加會提高水稻幼芽中MDA含量，且隨著銅離子濃度的增加，MDA含量不斷上升。當銅離子濃度為10 mg·L-1時，與對照相比，丙二醛含量提高了296.98%。

表1 不同濃度銅離子對水稻種子萌發的影響Table 1 Effects of different concentrations of copper ion on seed germination of rice

表2 不同濃度銅離子對水稻種子銅離子吸收量和質膜透性的影響Table 2 Effects of different concentrations of copper ion on copper ion uptake and plasma membrane permeability on seed germination of rice

表3 不同濃度銅離子對水稻MDA含量和抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of different concentrations of copper ion on rice MDA and the effects of antioxidant enzymes

抗氧化酶（CAT、POD、SOD）是細胞內清除活性氧系統中的重要酶，能有效阻止氧離子（O2-）和過氧化氫（H2O2）在植物體內的積累。從表3的結果可以看出，銅離子脅迫條件下，水稻中CAT、SOD、POD 3種抗氧化酶的活性均小于對照組，且除POD變化不大外，CAT和SOD的活性均隨銅離子濃度的增加而持續降低。當銅離子濃度為10 mg·L-1時，與對照相比，CAT活性下降了49.50%，SOD活性下降了28.49%，POD活性下降了38.24%。

2.2 銅離子脅迫下茶樹菇菌糠多糖對水稻種子萌發及生理特性的影響

2.2.1 對水稻種子萌發的影響

茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻種子的萌發具有促進作用。由表4可知，隨著茶樹菇菌糠多糖濃度的增加，種子的發芽勢和發芽率均先增加后降低，其中1000 mg·L-1茶樹菇菌糠多糖對種子的發芽勢和發芽率促進作用最為顯著，與銅離子脅迫下不添加茶樹菇菌糠多糖相比，分別提高了51.76%和10.01%，接近CK組的生長指標。

表4 不同濃度茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻種子萌發的影響Table 4 Effects of different concentrations of agrocybe cylindracea spent mushroomsubstrate polysaccharide on rice seed germination under copper ion stress

2.2.2 對水稻種子根和芽生長指標的影響

由圖1和圖2可知，茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻幼芽生長促進效果不顯著，但對根系生長的促進效果顯著。隨著茶樹菇菌糠多糖濃度的增加，其對水稻幼根生長促進效果也逐漸增強，與不添加茶樹菇菌糠多糖相比，分別提高了15.02%、40.77%、34.33%、96.14%、54.94%，但與CK相比存在一定的差距。

2.2.3 對水稻種子銅離子吸收量及質膜透性的影響

由圖3可知，隨著茶樹菇菌糠多糖濃度的增加，水稻幼苗根部和幼芽的銅離子含量呈先上升后下降的趨勢，其中當多糖濃度為100 mg·L-1時，根部和幼芽銅離子的含量最高。不同濃度的茶樹菇菌糠多糖均可以顯著降低根和芽的相對電導率，降低銅離子對植物細胞膜的損傷。

2.2.4 對水稻種子根尖質膜完整性的影響

伊文思藍染色法可以很好地觀察植物細胞的質膜損傷情況。由圖4可知，通過伊文思藍染色法對銅離子脅迫下添加茶樹菇菌糠多糖對水稻種子根尖進行染色分析發現，銅離子添加會顯著增加細胞的染色深入，而隨著菌糠多糖的添加，其染色強度會逐步下降，說明添加不同濃度的茶樹菇菌糠多糖對水稻種子根尖質膜有一定的保護作用。

2.2.5 對水稻種子可溶性糖和蛋白的影響

由圖5可以看出，銅離子脅迫且添加茶樹菇菌糠多糖下水稻種子可溶性糖與可溶性蛋白呈現大致相同的變化趨勢。與CK相比，銅離子脅迫條件下可溶性糖與可溶性蛋白均有提高，提高量分別為47.36%和25.81%。在添加不同濃度茶樹菇菌糠多糖的條件下，可溶性糖與可溶性蛋白都有一定程度的下降，其中10 mg·L-1時效果最佳，與未添加多糖處理相比，可溶性糖與可溶性蛋白分別下降了40.95%和33.84%。

圖1 不同濃度茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻根長、芽長、根鮮重和芽鮮質量的影響Figure 1 Effects of different concentrations of agrocybe cylindracea spent mushroom substrate polysaccharide on root length，shoot length，root fresh weight，shoot fresh weight of rice under copper ion stress

圖2 不同濃度茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻種子萌發的影響Figure 2 Effects of different concentrations of agrocybe cylindracea spent mushroomsubstrate polysaccharide on rice seed germination under copper ion stress

圖3 不同濃度茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻種子銅離子吸收量和質膜透性的影響Figure 3 Effects of different concentrations of agrocybe cylindracea spent mushroomsubstrate polysaccharide on copper ion uptake and plasma membrane permeability of rice under copper ion stress

2.2.6 對水稻種子MDA含量及抗氧化酶活性的影響

銅離子脅迫下添加茶樹菇菌糠多糖可以緩解銅離子對水稻種子的毒害作用，降低MDA含量，顯著提高抗氧化酶的活性。由圖6可知，與CK相比，未添加多糖處理下MDA含量提高了349.66%，而添加不同濃度茶樹菇菌糠多糖與未添加多糖處理相比，分別下降了10.20%、10.52%、29.02%、45.75%、53.91%；與CK相比，未添加多糖處理下抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性分別下降了34.5%、33.79%、9.27%，而添加不同濃度茶樹菇菌糠多糖與未添加多糖處理相比，CAT活性分別提高了44.66%、58.78%、66.41%、87.79%、59.16%；POD活性分別提高了22.52%、69.21%、61.92%、57.62%、45.70%；SOD活性分別提高了 6.94%、10.40%、12.99%、17.46%、15.53%。

圖4 發芽第8 d不同濃度茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻根尖質膜完整性的影響Figure 4 Effects of different concentrations of agrocybe cylindracea spent mushroomsubstrate polysaccharide in the rice root tip cells at eighth day under copper ion stress

圖5 銅離子脅迫下茶樹菇菌糠多糖對水稻種子可溶性糖和蛋白的影響Figure 5 Effects of different concentrations of agrocybe cylindracea spent mushroom substrate polysaccharide on soluble sugar and protein of rice under copper ion stress

3 討論

茶樹菇是一種極具開發潛力的珍稀食藥用菌，其栽培數量和產品市場占有率目前已超過香菇[19]。菌糠是真菌收獲后的培養基剩余物，含有大量的食用菌菌絲體，富含多糖等活性成分。現有研究表明，茶樹菇菌糠多糖是一種具有良好抗氧化性[20-21]及免疫調節[22]活性的大分子物質，可用于動物免疫添加劑等領域。這不僅可以解決廢棄菌糠對環境的污染問題，還能實現菌糠的資源化利用[23]。目前研究表明，植物多糖[24]、動物多糖[25]、微生物多糖[26]等均能夠增加植物的抗逆性，提高作物在逆境條件下的生長特性。本研究結果表明，添加茶樹菇菌糠多糖能顯著提高銅離子脅迫條件下水稻種子的發芽勢和發芽率，促進根系的生長，修復根部細胞的質膜損傷，抑制MDA的含量，提高抗氧化酶活性，這一效應在水稻幼苗根部體現得尤為突出。上述結論與Katiyar等[27]的研究成果以及本課題組前期工作結果是相一致的。

多糖通過何種途徑改善脅迫條件下作物生長特性目前尚無統一結論。從現有研究來看，目前較為公認的有以下幾種途徑：（1）通過一氧化氮和過氧化氫信號傳導途徑增強抗氧化酶系統活性，從而增強植物抵御傷害的防御系統能力[28]。Zou等[29]發現紫斑擬南芥多糖可以調節小麥幼苗體內的抗氧化酶活性和細胞內離子的濃度，從而保護小麥免受鹽脅迫的傷害；Zong等[30]通過在鎘脅迫下的油菜生長過程中添加外源殼聚糖，發現殼聚糖提高了油菜葉片中POD、SOD、CAT活性，降低了葉片內MDA和鎘含量，增強了油菜對鎘的耐受性。（2）多糖可作用于植物細胞，誘導合成與滲透調節、應激信號傳遞和能量代謝相關的有機酸、糖、氨基酸及其他代謝產物，進而增強植物生理反應并減輕脅迫下的不利后果[31]。李莉等[32]發現，經海藻糖預處理過的小麥在NaCl脅迫條件下生長時，其細胞電解質滲透率和脯氨酸含量顯著降低，而葉綠素含量、根系活力、干物質積累量和生長速度則均有提高，表明海藻糖可以提高作物幼苗對高鹽的抗逆能力。（3）多糖可以作為重金屬的吸附劑，與環境中的重金屬形成絡合物，從而降低重金屬的毒害作用[33]。Tao等[34]研究了不同胞外多糖對銅和鋅的生物吸附能力，結果表明各種多糖對銅離子都有良好的吸附效果，而且其吸附作用主要是通過羥基、羧基和酰胺等化學基團來完成；Hou等[35]比較了野生型和突變型金氏中華根瘤菌所產胞外多糖對銅離子的吸附能力，結果表明多糖可以通過表面的官能團吸附銅離子，而且吸附能力與其結構有關，表面粗糙且具有蜂窩狀結構的胞外多糖對銅離子吸附能力更強。

圖6 不同濃度茶樹菇菌糠多糖對銅離子脅迫下水稻種子MDA含量和抗氧化酶活性的影響Figure 6 Effects of different concentrationsof agrocybe cylindracea spent mushroomsubstrate polysaccharide on MDA and the effects of antioxidant enzymes of rice under copper ion stress

水稻根部是吸收銅等金屬離子的首要器官，其銅離子含量相對于芽部來說可高出20倍以上，因此也是受重金屬脅迫最為嚴重的部位[36]。過量的銅會導致植株細胞結構受損，誘導植株體內ROS的形成，從而激活自身的抗氧化系統，并對銅誘導的氧化應激表現出適應性反應[37]，嚴重影響水稻的生理代謝。本研究結果表明，隨著銅離子濃度的升高，根和芽的銅離子含量均先增后降，這與徐健程等[38]的研究結果一致，而高濃度銅離子條件下水稻體內重金屬含量的降低，可能與重金屬離子嚴重抑制了水稻的生理代謝活力有關。Kamari等[39]在黑麥草和油菜籽培養時添加殼聚糖，研究其對植物吸收Pb、Zn、Cu效率的影響，結果發現在黑麥草生長過程中添加低濃度多糖可以提高重金屬吸收率，而高濃度多糖則降低了重金屬吸收率，但在油菜籽生長過程中添加低濃度多糖降低了重金屬Cu吸收率，高濃度多糖則提高了重金屬Cu的吸收率，而對重金屬Pb、Zn的吸收率卻隨著多糖濃度的升高而降低。上述結果表明多糖影響重金屬吸收效率可能會隨著植物種類的變化而產生不同的效果。

在重金屬脅迫條件下的水稻生長過程中添加多糖后，重金屬的毒害作用會顯著下降。本研究通過伊文思藍染色可以清晰地看出，隨著多糖濃度的升高，水稻根部細胞受到的傷害會減弱，并在多糖的誘導作用下細胞功能得到一定的恢復。隨著多糖濃度的持續升高，水稻細胞的滲透壓也相應上升，可溶性蛋白和糖含量降低，這可能是水稻所產生的銅結合蛋白等大分子物質的數量減少所造成的[40]，這一結果與前人[40-41]研究的結論相一致。同時，對水稻體內抗氧化系統的活力測定結果表明，銅脅迫會導致水稻幼芽的抗氧化酶活性不同程度地降低，同時顯著提高水稻幼芽MDA含量，而經菌糠多糖浸種后，脅迫條件下水稻幼芽中的MDA含量顯著降低，CAT、POD、SOD活性均顯著提高，這與張文平等[12]的研究結果一致，說明多糖的添加在一定程度上緩解了重金屬對水稻所造成的氧化傷害。伊文思藍染色結果也表明菌糠多糖可以顯著降低細胞膜脂過氧化，減少活性氧的產生，緩解銅脅迫對水稻的過氧化傷害，這與Yang等[42]研究一致。

4 結論

（1）銅脅迫條件下水稻種子的萌發會受到顯著抑制，同時其正常生理代謝也會受到嚴重影響，其中水稻根部的結構與功能受銅離子添加的影響尤為顯著。

（2）添加不同濃度茶樹菇菌糠多糖可以在一定程度上緩解銅離子對水稻種子萌發過程的毒害作用，提高銅離子脅迫條件下水稻種子的發芽勢和發芽率，促進水稻根的生長，修復細胞質膜損傷，降低可溶性糖和可溶性蛋白的含量，提高抗氧化系統活性，最終緩解銅離子對水稻幼苗的毒害作用。