三嗪類農藥復合污染物對蛋白核小球藻的聯合毒性作用評估

王 滔，班龍科，張 瑾，卞志強，潘法康

（安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥230601）

農藥在糧食生產和農業發展中使用量很大，我國以占全球7%的耕地面積養活了占全球22%的人口，其中農藥發揮著關鍵作用[1]。施用的農藥中只有10%能得到利用，而其余部分則會通過下滲和雨水沖刷等方式殘留在環境中。殘留農藥可能通過食物鏈的傳遞作用進入人體，對人類健康構成威脅[2-3]。三嗪類農藥主要用于防除禾本科雜草和闊葉雜草，是國內外應用廣泛的高效除草劑之一，且該類藥物具有水溶性強、化學性質穩定的特點，因而會對環境產生更持久的不利影響[4-7]。有研究表明，三嗪類農藥是黃、淮海及松遼流域等不同水域中的主要檢出農藥[5]。

傳統農殘檢測通常是按照標準項目逐個檢測，這種方法可能會低估農藥殘留的風險[8-9]。由于環境中的農藥會以各種形式和濃度共存，形成復雜的混合物并產生聯合毒性，從而會對生物產生更大的風險，因此開展農藥聯合毒性作用分析的研究就顯得尤為重要[10-12]。除濃度加和模型以外，等效線分析法也是比較經典的聯合毒性作用評估方法，可全面考察某指定效應下混合物的毒性相互作用情況[13-14]。傳統等效線圖法適用于二元混合物聯合毒性評估，有學者在此基礎上還構建了適用于三元混合物的三維等效圖法，并能直觀地反映三元混合物聯合毒性特征[15]。

因此，本研究選擇在多種農作物中均被檢出過的3種三嗪類農藥[4，16]：苯嗪草酮（Metamitron，Met）、草凈津（Bladex，Bla）、特丁通（Terbumeton，Ter）為混合物組分，以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa，C.pyrenoidosa）為實驗生物，分別采用直接均分射線法（Equipartition ray，Equ-Ray）和均勻設計射線法（Uniform design ray，UD-Ray）設計具有代表性的二元及三元混合物體系，應用微板毒性分析法（Microplate toxicity analysis，MTA）考察三嗪類農藥及其混合物體系的毒性，通過濃度加和（Concentration addition，CA）模型分析混合物毒性相互作用，并建立二維和三維等效圖進一步評估混合物聯合毒性，通過葉綠素a含量的測定考察三嗪類農藥對蛋白核小球藻的生理毒性作用，以期為科學評價三嗪類農藥的環境風險提供基礎數據，為三嗪類農藥在農業生產中的科學應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種、儀器及藥品

1.1.1 藻種與儀器

實驗藻種蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）購自中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB），藻種的培養與保存方法參見文獻[17]。

主要實驗儀器：Synery-2酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）、MGC-250光照培養箱（上海一恒科技有限公司）、YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）、721型分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.1.2 藥品

農藥：苯嗪草酮（Met）、草凈津（Bla）及特丁通（Ter）均購自上海原葉生物科技有限公司。表1列出了3種農藥的基本理化性質，圖1為3種農藥的化學結構。3種藥物濃度均在溶解度范圍內，使用超純水配制藥物儲備液，并于4℃冰箱儲存、備用。

1.2 混合物設計

在化學混合物中，各組分毒性大小及組分間毒性相互作用決定了混合物的整體毒性，且毒性大小及組分間毒性相互作用與暴露時間和濃度有關。為系統考察混合物的毒性作用規律，分別采用Equ-Ray和UD-Ray設計農藥二元及三元混合物體系[18-20]，表2為各混合物射線的組分及其濃度比Pi值。

表1 3種三嗪類農藥的理化性質Table 1 The physiochemical propertiesof three triazine pesticides

圖1 3種三嗪類農藥的化學結構Figure 1 The chemical structures of three triazine pesticides

1.3 時間毒性測定與計算

應用基于蛋白核小球藻的微板毒性分析法，測定農藥及其混合物對C.pyrenoidosa的時間毒性，采用透明的96孔微板作為實驗載體[21-23]。微板實驗設計方法：在微板最外側36個孔中，均加入200μL超純水，以減少邊緣效應的影響；在第3列和第8列共12個孔中，從上至下依次加入按稀釋因子設計的不同濃度藥物溶液100μL；第4列和第5列為第3列的平行實驗；第10列和11列為第8列的平行實驗；在第2、6、7、11列共24個孔中均加入100μL超純水作為空白對照組；最后在處理組和空白組共60個孔中均加入吸光度為0.20～0.30的100μL藻液，使每個微孔中總體積為200μL，加透明蓋以減少溶劑揮發。重復以上操作 3次[17]。

將加入藥物和C.pyrenoidosa的微板置于（25±1）℃、5000 lx的培養箱中培養，分別在12、24、48、72 h和96 h后取出，應用酶標儀測定690 nm波長下的吸光度，并計算各暴露時間下藥物對C.pyrenoidosa的生長抑制率。

蛋白核小球藻抑制率的計算公式如下：

式中：I為抑制率；OD0為對照組的吸光值；OD為實驗組的吸光值。

1.4 時間毒性數據擬合

為反映C.pyrenoidosa在不同暴露時間、不同藥物濃度下的生長變化規律，采用時間-濃度-效應三維曲線的方法。對于不同暴露時間的濃度-效應數據，采用Logit函數進行擬合，并根據擬合相關系數（Correlation coefficient，R2）與 均 方 根 誤 差（Root mean square error，RMSE）判斷擬合效果，R2越接近 1 且RMSE越接近0，說明擬合效果越好[21]。毒性實驗中的實驗誤差無法避免，因此在描述擬合函數不確定度時，利用觀測置信區間（Observed confident interval，OCI）來表征毒性實驗數據的準確程度[24]。

非線性Logit函數公式如下：

式中：E為毒性效應即生長抑制率；c為藥物的濃度，mol·L-1；α和β分別為位置和斜率參數。

1.5 混合物毒性相互作用分析

1.5.1 濃度加和模型

混合物毒性相互作用的識別具有重要意義，目前國內外常采用CA作為加和參考模型，且該模型可用于評估多數農藥的混合物毒性[25-27]。當CA預測曲線位于OCI內，毒性相互作用表現為加和作用；當位于OCI以下時，則為協同作用；當位于OCI以上時，則為拮抗作用[28]。

CA模型數學表達式如下：

表2 混合物體系的組分及其濃度比Table 2 The components and their concentration ratios of three binary and one ternary mixture systems

式中：Ci表示混合物產生x%效應時第i組分的濃度，mol·L-1；ECx，i表示混合物中第 i個組分單獨作用時產生x%效應時的濃度，mol·L-1。

1.5.2 二維等效圖

對于二元混合物系統，利用二維等效線圖法可全面考察某指定效應下不同混合比射線的毒性相互作用。利用濃度-效應曲線（Concentration response curve，CRC）函數計算某一等效應下混合物濃度，根據擬合曲線的95%OCI確定該效應的置信上下限濃度，以兩組分的毒性單位（Toxic unit，TU）為坐標繪制二維濃度圖，等效點及其置信區間形成等效線段，基于CA模型繪制加和等效線。通過等效線段與加和等效線的位置關系可判斷毒性相互作用的類型，且等效線段偏離程度越大，毒性相互作用越明顯。若等效線段位于加和等效線下方，表示二元混合物組分間毒性相互作用為協同作用；若位于加和等效線上方，則為拮抗作用；若與加和等效線相交，則呈現為加和作用。

1.5.3 三維等效圖

對于三元混合物系統，利用三維等效線圖法可考察任意效應水平下組分間的毒性相互作用，其構建方法參見文獻[15]。三維等效圖中三角平面為濃度加和等效面，各條線段對應于不同混合物射線的半數效應濃度及置信區間。如果線段位于三角平面右上方，說明混合物毒性相互作用為拮抗作用；若線段與三角平面相交，則為加和作用；若線段位于三角平面左下方，則為協同作用[27]。

1.6 C.pyrenoidosa中葉綠素a含量的測定

光合作用是植物體內最重要的生命活動，葉綠素也是各種浮游藻類中廣泛存在的色素，因而其含量能客觀反映植物的生長情況和光合作用水平[29]。對于C.pyrenoidosa，其體內的葉綠素a含量變化比葉綠素b對污染物的響應更為敏感[30]，因此本文選擇葉綠素a含量為指標，考察不同藥物作用下葉綠素a含量隨暴露時間和暴露濃度的變化情況。

葉綠素a含量的測定方法：取對數生長期的蛋白核小球藻藻液10 mL，用0.45μm的混合纖維素膜進行過濾，將帶有藻細胞的濾膜置于冰箱冷凍過夜，取出后迅速加入體積分數為95%的乙醇溶液萃取2 min，將萃取液超聲破碎15 min，于暗處靜置4 h后以5000 r·min-1冷凍離心5 min，取上清液置于比色皿中，分別在665 nm和649 nm波長下測定吸光值[30-31]。

葉綠素a含量計算公式如下：

式中：Pchla為葉綠素a含量，mg·L-1；OD665為665 nm波長下的吸光值；OD649為649 nm波長下的吸光值；V1為定容體積，mL；V2為樣品的體積，mL；L為比色皿光程長度，cm。

每組藥物在10%、30%、50%及70%4個效應濃度下進行毒性實驗，并以加入超純水的藻液作為空白對照，分別在暴露時間48 h和96 h測定葉綠素a的含量。

2 結果與分析

2.1 3種農藥對C.pyrenoidosa的毒性效應

通過MTA法測得3種三嗪類農藥對C.pyrenoidosa的濃度-效應數據，利用Logit函數進行最小二乘擬合，其擬合參數α、β值以及統計結果（R2和RMSE）見表3，擬合曲線（CRCs）以及實驗觀測數據見圖2。

從表3可看出，Logit函數能較好擬合3種農藥對C.pyrenoidosa在不同暴露時間的濃度-效應數據，R2除在暴露時間12 h外均大于0.97，RMSE均小于0.1。在暴露時間12 h時的擬合效果稍差，可能是由于C.pyrenoidosa處于生長適應階段，也可能需要其他更適合的函數進行擬合。

表3 3種三嗪類農藥的Logit函數擬合參數、統計量、半數效應濃度（EC50）及其負對數（p EC50）Table 3 The Logit function fitting parameters and statistics，mean effect concentration and its negative logarithmfor the three triazine pesticides

不同農藥對C.pyrenoidosa的毒性大小不同，且隨暴露時間延長，毒性大小順序也會發生改變。以EC50負對數值p EC50為毒性大小指標，暴露時間12 h時，毒性大小順序為Met＞Bla＞Ter；暴露時間24 h時，毒性大小順序為Ter＞Bla＞Met；暴露時間為48、72、96 h時，毒性大小順序保持不變，為Bla＞Ter＞Met。3種農藥在48 h及以后的EC50值變化不大，說明3種農藥具有明顯的急性毒性，即生物在接觸藥物后，農藥產生毒性較快，且迅速達到最大，此后隨暴露時間延長，而不再有明顯的增加。

3種農藥對C.pyrenoidosa的時間-濃度-效應曲線如圖2所示。從圖中可以看出，C.pyrenoidosa在3種農藥單獨作用下，抑制率隨時間和濃度的變化規律稍有差異。在低濃度Met的各個暴露時間，農藥對C.pyrenoidosa的抑制率都接近為0，而在中濃度和高濃度區域的抑制率則明顯增加，尤其在暴露72 h和96 h時，高濃度區域的抑制率接近100%。農藥Bla和Ter單獨作用于C.pyrenoidosa時的抑制率變化規律相似，即在低濃度農藥暴露下，農藥對C.pyrenoidosa的抑制率隨暴露時間延長先增加后降低，在中濃度和高濃度區域的抑制率，則隨暴露時間延長而逐漸增加。

2.2 農藥二元混合物對蛋白核小球藻的毒性相互作用

采用Equ-Ray法設計3組農藥二元混合物體系，基于CA模型對不同暴露時間的混合毒性進行預測。在混合物暴露12 h和24 h時，C.pyrenoidosa處于生長適應階段，生物代謝反應緩慢，無法用CA模型準確判斷毒性相互作用。圖3為3組二元混合物體系暴露48、72 h和96 h時的實驗觀測值及其95%OCI、擬合曲線及CA預測曲線。

從圖3可看出，Met-Bla二元混合物體系中，Met所占濃度比例從R1射線到R5射線逐漸增加。在同一暴露時間下，隨Met濃度比增加，CA預測曲線與濃度-效應擬合曲線之間的偏離程度越來越大，毒性相互作用由部分加和、部分協同逐漸轉變為整個濃度區域的協同作用。對于同一條混合物射線，隨暴露時間延長，CA預測曲線偏離95%OCI程度越來越大，協同作用越來越明顯。表明Met-Bla二元混合物毒性相互作用具有明顯的時間依賴性和濃度比依賴性。

Met-Ter二元混合物體系中，Ter所占濃度比從R1射線到R5射線逐漸增加。在同一暴露時間下，隨Ter濃度比增加，CA預測曲線與濃度-效應擬合曲線之間的距離整體呈減小趨勢，毒性相互作用為協同作用且逐漸減弱。對于同一條混合物射線，隨暴露時間延長，CA預測曲線偏離95%OCI程度越來越大，協同作用越來越明顯。表明Met-Ter二元混合物毒性相互作用具有時間依賴性和濃度比依賴性。

圖2 3種農藥對C.pyrenoidosa的時間-濃度-效應曲線Figure 2 The time-concentration-effect curve of three triazine pesticides on C.pyrenoidosa

圖3 二元混合物體系代表性射線的效應數據、擬合曲線、95%置信區間曲線及CA預測線Figure 3 The effect data，fitted curve，95%confidential intervals and predicted curve by CA of representative ray of binary mixture systems

續圖3二元混合物體系代表性射線的效應數據和擬合曲線、95%置信區間曲線及CA預測線Continued figure 3 The effect data，fitted curve，95%confidential intervals and predicted curve by CA of representative ray of binary mixture systems

續圖3二元混合物體系代表性射線的效應數據和擬合曲線、95%置信區間曲線及CA預測線Continued figure 3 The effect data，fitted curve，95%confidential intervals and predicted curve by CA of representative ray of binary mixture systems

Bla-Ter二元混合物體系中，Ter所占濃度比從R1射線到R5射線逐漸增加。在同一暴露時間下，隨Bla濃度比增加，CA預測曲線與濃度-效應擬合曲線間的位置關系沒有明顯變化規律。對于同一條混合物射線，隨暴露時間延長，CA預測曲線偏離95%OCI程度越來越大，毒性相互作用由加和作用逐漸轉變為協同作用。表明Bla-Ter二元混合物毒性相互作用具有明顯的時間依賴性。

選擇暴露時間96 h的半數效應濃度EC50繪制農藥二元混合物的二維等效圖（圖4），考察50%效應時不同混合比射線的毒性相互作用。由圖4可看出，所有農藥二元混合物體系各條射線的等效線段均位于濃度加和等效線下方，呈現出顯著的協同作用，尤其是Met-Bla混合物R3射線的等效線段偏離程度最大，所呈現的協同作用最強。這一結果和農藥二元混合物射線CA預測結果基本吻合，且能更直觀地反映指定效應下所有射線的毒性相互作用情況。

2.3 農藥三元混合物對蛋白核小球藻的毒性相互作用

采用UD-Ray法設計農藥三元混合物體系，基于CA模型對農藥三元混合物在不同暴露時間的混合毒性進行預測，發現三元混合物5條射線具有相似的規律，且沒有隨時間發生明顯變化。圖5為Met-Bla-Ter三元混合物具代表性射線的實驗觀測值及其95%OCI、擬合曲線、CA預測曲線。

從圖5中可以明顯看出，農藥三元混合物R1、R2和R5射線的CA預測曲線均落在實驗觀測95%置信區間以內，毒性相互作用表現為加和作用，且隨著暴露時間延長，毒性相互作用未發生改變。本研究中CA模型也可較準確預測3種農藥的混合物對蛋白核小球藻的毒性。

選擇暴露時間96 h的半數效應濃度EC50繪制農藥三元混合物的三維等效圖（圖6）。由圖可看出，農藥三元混合物體系中，濃度加和等效面與混合物射線的EC50置信區間線相交，表明農藥混合物射線在EC50水平下呈加和作用。這一結果與農藥三元混合物射線的CA預測線及CRC間關系相吻合，進一步說明三維等效圖法分析結果的可靠性。

2.4 農藥及其混合物對蛋白核小球藻葉綠素含量的影響

選擇3種農藥及其二元混合物R3射線、三元混合物R5射線進行葉綠素測定實驗，在擬合曲線CRCs相關參數的基礎上，計算不同藥物對C.pyrenoidosa產生10%、30%、50%及70%抑制效應時的濃度。分別在暴露時間48 h和96 h測定C.pyrenoidosa中葉綠素a的含量，并根據對照組含量，計算不同暴露時間及不同抑制效應下的葉綠素a減少率，結果如圖7所示。

圖6 農藥三元混合物射線在EC50下的三維等效圖Figure 6 Three-dimensional isobiologram of pesticide ternary mixture rays responding to the effect of 50%

圖4 農藥二元混合物射線在EC50下的二維等效圖Figure 4 Two-dimensional isobiolograms of pesticide binary mixture rays responding to the effect of 50%

圖5 三元混合物體系代表性射線的效應數據、擬合曲線、95%置信區間曲線和CA預測線Figure 5 The effect data，fitted curve，95%confidential intervalsand predicted curve by CA of representative ray of ternary mixture systems

從圖7可明顯看出，C.pyrenoidosa分別在48 h和96 h暴露時間下，隨著藥物效應濃度的增加，葉綠素a含量逐漸減小，且在對照組基礎上計算出的減少率逐漸變大，這與各組藥物對應的CRCs曲線變化趨勢基本一致。

雖然葉綠素a減少率與濃度效應曲線變化規律相似，但在不同組藥物的作用下，減少率變化的程度明顯不同。在農藥Met及Met-Ter暴露下，各效應濃度時的葉綠素a減少率均小于其抑制效應，以農藥Met-Ter暴露96 h為例，效應濃度10%、30%、50%和70%對應的葉綠素a減少率分別為6.66%、10.66%、30.46%和60.85%。在農藥Met-Bla暴露下，各效應濃度時的葉綠素a減少率均大于其抑制效應，效應濃度10%、30%、50%和70%對應的葉綠素a減少率分別為10.76%、40.28%、60.53%和81.34%。而在農藥Bla、Ter、Bla-Ter和Met-Bla-Ter暴露下，各效應濃度時的葉綠素a減少率與相應抑制效應基本一致。

3 討論

李威等[30]在研究中發現，5氟尿嘧啶對藻類的毒性沒有明顯的時間-效應關系。陶夢婷等[32]也發現，草甘膦低濃度暴露對青海弧菌的毒性沒有時間依賴性。本研究中，3種農藥對C.pyrenoidosa的毒性也具有一定的時間和濃度依賴性，即整體上呈現為隨暴露時間的延長和暴露濃度的增加，毒性逐漸增強。但在低濃度區域的毒性變化卻沒有時間依賴性，這可能是生物適應等原因所致[33]。沈國興等[34]的研究也發現，許多農藥在高濃度作用下會對藻類產生毒害作用，而在低濃度時則無毒性效應，并且提出農藥對藻類同時存在毒害和降解兩個過程，在低濃度時降解占主導地位表現為無毒性效應，在高濃度時毒害作用占主導地位表現為毒性效應。C.pyrenoidosa在低濃度Met暴露下幾乎沒有毒性作用，而在低濃度Bla和Ter暴露下，毒性作用隨暴露時間延長先增強后逐漸減弱；在中濃度和高濃度區域有一定的時間和濃度依賴性，Met對C.pyrenoidosa的毒性出現突然增強，而Bla和Ter對C.pyrenoidosa的毒性則逐漸增強。這與陶夢婷等[32]在農藥對青海弧菌毒性作用研究中的結果類似。

多種化合物同時作用于生物會產生聯合毒性，可能通過作用于相同的靶器官產生加和作用[35]，通過組分間結構互補性產生協同作用[36]，通過競爭作用位點產生拮抗作用[37]。在考察三嗪類農藥混合物毒性基礎上，進一步研究了混合物毒性相互作用隨時間和組分濃度的變化。農藥二元混合物體系Met-Bla和Met-Ter的毒性相互作用，均具有明顯的時間依賴性和濃度比依賴性，Bla-Ter體系只具有明顯的時間依賴性。但不同混合物體系隨暴露時間和組分濃度比改變，其毒性相互作用呈現各異的規律，說明混合物毒性相互作用機理較復雜，需要進一步做分子水平方面的研究。

二維等效線圖法常用于二元混合體系中多種濃度比混合物的毒性相互作用分析，且多選擇EC50為等效應濃度參考點[38-39]，但這種傳統等效線圖法只能反映EC50效應下二元混合物毒性相互作用情況。本研究中的三維等效線圖法評估3種三嗪類農藥混合物對蛋白核小球藻的毒性相互作用，拓展了等效線圖法的應用范圍，較直觀地反映3種組分聯合毒性作用情況，但目前只是針對混合物的EC50濃度水平的評估，有待于進一步探討三維等效線圖的多水平應用。

4 結論

（1）Logit函數能較好地擬合3種三嗪類農藥及其混合物體系對C.pyrenoidosa的濃度-效應數據，在暴露時間48 h及以上，3種農藥的毒性大小順序為Bla＞Ter＞Met。

（2）二元混合物的毒性相互作用整體上呈現為加和作用向協同作用的轉變。Met-Bla和Met-Ter二元混合物體系毒性相互作用具有時間依賴性和濃度比依賴性，而Bla-Ter二元混合物體系的毒性相互作用只有時間依賴性。根據3個混合物體系的二維等效線圖，可看出各混合物體系在EC50效應下均具有較強的協同作用。

（3）農藥三元混合物體系對C.pyrenoidosa的毒性作用表現為加和作用，且隨暴露時間延長，作用類型未發生改變，混合物三維等效圖與對應CA模型的分析結果一致，且毒性作用更加直觀，也說明三維等效圖分析結果的可靠性。

（4）3種農藥及其混合物射線中，C.pyrenoidosa葉綠素a含量的減少率與各組藥物對應的CRCs曲線變化趨勢基本一致。但在不同藥物作用下，C.pyrenoidosa生理毒性與種群水平毒性間關系稍有差異。

圖7 C.pyrenoidosa中葉綠素a含量及減少率的變化Figure 7 Changes of chlorophyll-a content and reduction rate in C.pyrenoidosa