碳量子點/曙紅Y比率型熒光探針測定L-抗壞血酸

武文波， 張越誠， 李承佳， 馬紅燕， 楊曉軍

(延安大學化學與化工學院 延安市分析技術與檢測重點實驗室, 陜西 延安 716000)

1 引 言

L-抗壞血酸(L-ascorbic acid,Ascorbic acid,AA)又稱維生素C，是一種富含于水果和蔬菜中的水溶性維生素，也是維持機體正常生理功能的重要元素之一。AA在美白、組織修補、維持免疫功能、保持血管完整等過程中起著至關重要的作用，而長期缺乏AA則可能會引起敗血癥[1]。由于人體不能自身合成，只能從食物和藥物中攝取，因此，對于食品藥物中AA的分析具有重要意義[2]。目前，定量檢測AA的方法有FTIR[3]、自動電位滴定[4]、HPLC[5]、紫外分光光度法[6]、動態比濁法[7]、伏安法[8]和熒光分析法[9]等。

碳量子點(CQDs)是一種新型的碳納米功能材料，由于其顯著的光學性能、低細胞毒性、良好的光穩定性、易于制備和環境友好等特性，在生物成像、光電催化、離子及藥物檢測等領域受到了廣泛關注[10]。目前，基于CQDs的“關-開”型AA熒光探針已有課題組報道[11-12]，但其信號僅基于單波長熒光強度信號檢測。由于熒光強度易受外部環境(如溫度、粘度)、儀器條件(如光散射、光漂白、背景光)等因素的影響，具有一定的波動性。而比率型熒光探針通常是將具有兩種發射特性、不同發射波長的熒光材料構建成熒光探針，使用單一波長激發下的兩個發射峰熒光強度比值的變化為信號，進行目標分析物的測定。兩個峰的信號比值可以減小干擾從而提高分析的靈敏度和準確度[13-14]。因此，比率型熒光探針可廣泛應用于化學傳感、環境檢測和生物分析等領域。目前，基于有機染料和半導體量子點比率熒光探針用于檢測金屬離子[15-16]、有機小分子[17]已有文獻報道，但半導體量子點內在的細胞毒性、較差的水溶性和生物相容性限制了其進一步的發展和應用。CQDs的低毒性和環境友好性使其成為一種良好的替代品，但基于CQDs的比率型熒光分析法報道較少[18]。

本文以天然生物質去皮的蓖麻為碳源，只加入水，無需添加其他試劑，采用一步水熱法合成了熒光性能良好的綠色蓖麻CQDs(CO-CQDs)。在紫外燈照射下，CO-CQDs的熒光發射峰位于405 nm處，呈藍色熒光；而曙紅Y(Eosin Y,EY)的熒光發射峰位于540 nm處，呈綠色熒光。CO-CQDs與EY可通過靜電引力、疏水作用力與氫鍵作用緊密結合，形成具有雙發射特性的CO-CQDs/EY比率型熒光探針，在紫外燈照射下，具有405 nm與540 nm兩個發射峰。實驗發現，Cr(Ⅵ)可顯著猝滅CO-CQDs/EY復合物于540 nm/405 nm雙發射峰處的熒光強度，而AA的加入僅可以使λem=540 nm處的熒光強度恢復，但λem=405 nm處的熒光強度基本不變。AA的濃度與該探針在540 nm/405 nm兩處的熒光強度比值呈良好線性關系，可用于樣品中AA含量的測定。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

測試儀器：F-2700型熒光分光光度計(日本日立儀器有限公司)；IR Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津儀器有限公司)；HT7700型透射電鏡(TEM)(日本日立儀器有限公司)；FLSP920型瞬態穩態熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器有限公司)。

EY(1.0×10-3mol/L)：準確稱取0.064 8 g EY，加入5.00 mL乙醇溶解，攪拌、超聲后用水定容至100 mL容量瓶，置于冰箱 (4 ℃) 備用，使用時逐級稀釋。

K2Cr2O7(6.0×10-3mol/L)：準確稱取0.176 5 g K2Cr2O7，加適量水溶解后轉移至100 mL容量瓶，定容，搖勻，備用。

AA標準溶液(1.0×10-3mol/L)：準確稱取0.017 6 g AA標準品(廣東光華科技股份有限公司)，用水溶解，定容至100 mL容量瓶，置于冰箱 (4 ℃) 備用，使用時逐級稀釋。

Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.00)，蓖麻子去皮(市售)，西紅柿和檸檬采購于當地某農貿市場。

實驗中所用水均是超純水，所用試劑均為分析純且沒有進行任何后期處理。

2.2 CO-CQDs和CO-CQDs/EY復合物的合成

CO-CQDs的合成：將干凈無雜質的蓖麻去皮、研碎，稱取15.00 g置于50 mL有聚四氟乙烯內襯的高壓釜中，加入30.00 mL水，180 ℃加熱22 h。待高壓釜冷卻至室溫，得到顏色為深棕色的CO-CQDs懸浮液，經濾紙、微孔濾膜(0.22 μm)依次過濾，定容至100 mL容量瓶，即得CO-CQDs溶液。稀釋200倍得CO-CQDs工作液，備用。

CO-CQDs/EY復合物的制備：將7.00 mL CO-CQDs工作液和3.00 mL EY(5.0×10-5mol/L)溶液加入15.00 mL pH=4.00的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中，將混合物在室溫下超聲處理30 min后，即得CO-CQDs/EY復合物溶液。

2.3 基于CO-CQDs/EY比率型熒光探針的AA測定

向一系列10 mL比色管中依次加入1.00 mL CO-CQDs/EY復合物溶液、1.50 mL pH=4.00的Na2HPO4檸檬酸緩沖溶液、1.50 mL 6.0×10-3mol/L K2Cr2O7溶液以及不同濃度的AA溶液，用超純水定容，搖勻，室溫靜置半小時，測定其在單一激發波長λex=320 nm下，λ405與λ540處的熒光強度，并計算其熒光強度比值I540/I405。

3 結果與討論

3.1 CO-CQDs的性質表征

圖1(a) CO-CQDs的透射電鏡(TEM)圖顯示CO-CQDs呈規則的球形形態，平均粒徑10 nm，且分散性好、無團聚現象。CO-CQDs的晶格形態可用XRD圖譜(圖1(b))表征，CO-CQDs在2θ為20.36°處有一個衍射寬峰，該峰為無定形態碳的特征峰，因此該CO-CQDs的晶型為無定型碳[19]。

圖1 CO-CQDs的透射電鏡圖(a)和XRD譜(b),不同激發下的CO-CQDs的熒光發射譜(c)和紅外光譜(d)。

Fig.1 Transmission electron micrograph(a), XRD spectrum(b), fluorescence emission spectra under different excitation(c) and FTIR spectra(d) of CO-CQDs.

3.2 基于AA測定的CO-CQDs /EY比率型熒光探針構建

隨后，實驗發現(圖2)，在320 nm的紫外光照射下，單獨的CO-CQDs與EY的發射峰分別位于405 nm(黑線)與540 nm(紅線)處。而CO-CQDs/EY復合物出現了兩個發射峰(藍線)，分別位于405 nm與540 nm處，這分別顯示出CO-CQDs和EY的特征峰，相較單一CO-CQDs與EY，CO-CQDs/EY復合物發射峰位置沒變，熒光強度略有降低，進一步說明CO-CQDs與EY二者之間有相互作用發生。二者復合實現了用單一波長激發而得到兩個熒光發射峰的設想。

進一步實驗表明，于CO-CQDs/EY溶液中加入Cr(Ⅵ)時，Cr(Ⅵ)可以與CO-CQDs/EY復合物相結合，形成有效的電子轉移[24]，使CO-CQDs/EY 405 nm與540 nm處的熒光強度均顯著降低(圖2綠線)，形成雙猝滅。FLSP920型瞬態穩態熒光光譜壽命擬合結果顯示,CO-CQDs/EY和CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)的加權平均熒光壽命[25]分別為1.65 ns和1.69 ns，τ0/τ≈1，表明Cr(Ⅵ)與CO-CQDs/EY體系之間是以靜態猝滅的方式相互作用的。

圖2 不同物質結合的熒光發射譜

Fig.2 Fluorescence emission spectra of different component

于CO-CQDs/EY- Cr(Ⅵ)體系中加入AA后(圖2粉線)，EY的熒光逐漸恢復，而CQDs的熒光強度基本保持不變。圖3(a)為Cr(Ⅵ)與AA作用的紫外-可見吸收光譜，由圖可知，于Cr(Ⅵ)溶液中加入AA，Cr(Ⅵ)和AA之間可發生電子轉移的氧化還原反應，使Cr(Ⅵ) 349 nm處的吸收峰消失。由于AA與Cr(Ⅵ)反應，AA可將Cr(Ⅵ)從CO-CQDs/EY復合物的表面脫落下來，阻隔了Cr(Ⅵ)與CO-CQDs/EY的反應。由于EY是包裹在CO-CQDs的周圍，所以其表面的Cr(Ⅵ)首先脫落下來，EY熒光恢復，其恢復程度與AA濃度呈線性關系(圖3(b))，而CQDs熒光強度不變，從而實現了用于檢測AA的比率型熒光探針的構建。該方法的基本原理如圖4所示。

圖3 Cr(Ⅵ)-AA體系的紫外-可見吸收光譜(a)和CO-CQDs/EY與不同濃度AA溶液作用的熒光發射光譜(b)

Fig.3 UV-Vis absorption spectra of Cr(Ⅵ)-AA systems(a) and fluorescence emission spectra of CO-CQDs/EY interaction with different concentrations of AA solutions(b)

圖4 CO-CQDs比率型熒光探針作用機理圖

3.3 測定條件的優化

3.3.1 酸度、緩沖溶液的種類及用量的影響

在不同酸度環境中，CO-CQDs和EY有不同的形態和存在型體，因此酸度對其熒光性質有很大的影響。試驗了不同酸度對CO-CQDs/EY體系的影響，如圖5所示，其熒光強度比值I540/I405在pH為3.78～9.00的范圍內保持恒定，因此，實驗選擇體系的酸度為4.00。此外，考察了HAc-NaAc、Na2HPO4-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉和BR等緩沖溶液種類和緩沖溶液的用量對體系I540/I405的影響。結果表明,加入1.50 mL pH=4.00的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液時,I540/I405值最佳。

圖5 CO-CQDs/EY、CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)、CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA的pH值優化圖。

Fig.5 pH optimization of CO-CQDs/EY, CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ), CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA.

3.3.2 Cr(Ⅵ)用量的影響

考察了Cr(Ⅵ)用量對體系的影響。結果表明,Cr(Ⅵ)用量太少，反應不完全，熒光響應值小；Cr(Ⅵ)用量過大，影響熒光恢復的效率。試驗了Cr(Ⅵ)溶液用量在0.1～2.0 mL范圍內對體系熒光強度比值I540/I405的影響，如圖6所示，實驗選擇Cr(Ⅵ)溶液用量為6.0×10-3mol/L 1.50 mL。

圖6 Cr(Ⅵ)的用量對CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)和CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA體系的影響

Fig.6 Effect of Cr(Ⅵ) amount on CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ) and CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA system

3.3.3 反應溫度的影響

實驗考察了不同溫度對體系熒光強度比值I540/I405的影響，結果表明，加熱對體系無任何增敏作用，實驗選擇不進行加熱。

3.3.4 體系的穩定性

實驗研究了不同的反應時間對體系熒光強度比值I540/I405的影響，如圖7所示。結果表明，CO-CQDs/EY體系的熒光信號比值在室溫下反應30 min可達穩定，且在7.5 h內保持不變。

圖7 反應時間對體系的影響

3.4 檢出限及線性范圍

在優化的實驗條件下，AA濃度在5.0×10-8～4.0×10-6mol/L范圍內與CO-CQDs/EY體系位于兩發射波長處熒光強度的比值I540/I405呈良好線性關系，線性方程為I540/I405=2.51+9.3×105c(mol/L),r=0.993 9，對濃度為1.0×10-6mol/L的AA進行5次平行測定，相對標準偏差為0.85%。

根據IUPAC規定，方法檢出限σ=3S/K=3.7×10-8mol/L。

3.5 共存物質的影響

3.6 實際樣品分析

3.6.1 藥片中AA含量的測定

隨機抽取同一批次的維生素C 10片(規格：0.1 g)，研磨成粉，準確稱取適量粉末(相當于0.017 6 g AA)，加水溶解，超聲后定容至100 mL容量瓶，搖勻、靜置10 min后過濾。準確移取濾液適量，按照實驗方法進行測定，同時進行加標回收實驗。結果見表1。

表1 藥片中AA測定及回收率實驗(n=5)

注：1. 廣東恒健制藥有限公司，產品批號：H44021171；2. 西安利君制藥有限責任公司，產品批號：1804176030。

3.6.2 水果和蔬菜中AA的測定

將新鮮蔬菜西紅柿和水果檸檬去皮取果肉，分別稱20 g置于研缽中，各加少許石英砂和20 mL 0.001% HCl充分研磨至勻漿，雙層紗布過濾至50 mL容量瓶中，0.001% HCl反復浸洗殘渣并濾入容量瓶，0.001% HCl定容[26]，混勻，稀釋100倍備用。取1.00 mL待測果蔬提取液，按照實驗方法進行測定，同時進行加標回收實驗，結果見表2。

表2 水果和蔬菜中AA的測定(n=5)

4 結 論

本文構建了一種基于AA高靈敏度檢測的CO-CQDs/EY復合物比率型熒光探針。以天然生物質蓖麻為前驅體一步水熱法合成了綠色熒光CO-CQDs，與熒光極強的鹵代熒光素染料EY復合，二者形成了熒光發射峰相距較遠的新型CO-CQDs/EY復合物。基于Cr(Ⅵ)的加入可使復合物405 nm/540 nm處的熒光發生雙猝滅、而AA只使540 nm處的熒光有恢復作用的現象，實現了基于CO-CQDs/EY雙發射比率型熒光探針對AA的測定。該體系簡單、靈敏，有效消除了熒光測定的背景干擾，為AA測定提供了新方法，為碳量子點在分析化學領域的應用提供了新思路。