不同分離方法及培養條件對人臍帶間充質干細胞生物活性的影響

徐斌　劉毅

[摘要]目的：觀察不同分離方法及培養條件對人臍帶間充質干細胞（Human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUCMSCs）生物活性的影響。方法：分別用組織塊貼壁法、酶消化法獲取hUCMSCs，進行原代培養，記錄各組首次傳代時間，相差顯微鏡觀察細胞的形態，流式細胞儀鑒定其CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR抗原表達。分別用DMEM-LG、DMEM-HG和DMEM-F12 3種培養基培養第3代、第7代細胞，MTT法比較不同時間點3種培養基培養細胞的生長情況。結果：兩種分離方法均能得到較均一的梭形或者多角形貼壁細胞，胞核大胞漿豐富，CD29、CD44、HLA-ABC抗原表達陽性，CD34、CD45、HLA-DR抗原表達陰性。用DMEM-F12培養的細胞活力更好，細胞生長更迅速。結論：兩種分離方法均能得到hUCMSCs，DMEM-F12培養基更能夠促進細胞的增殖，較適合于培養hUCMSCs。

[關鍵詞]組織塊貼壁法;酶消化法;人臍帶間充質干細胞;培養基;生物活性

[中圖分類號]Q813.1? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）02-0071-03

Abstract： Objective? To observe the effects of different separation methods and culture conditions on biological characteristics of hUCMSCs. Methods? The hUCMSCs were isolated form human umbilical cord by tissue adherence and digested with collagenase， the time of passage was recorded， in addition， the cell morphology was observed by phase contrast microscope， and the CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR antigen expression was identified using flow cytometry. The 3rd and the 7th generation cells were cultured with DMEM-LG， MEM-HG， and DMEM-F12 culture medium. MTT was used to evaluate the growth of hUCMSCs. Phase contrast microscope was used to observe the morphological changes of aging cells. Results? hUCMSCs could be separated by each method. The adherent cells showed shuttle or multiple angle shapes， with rich cytoplasm， and positive for CD29、CD44、 HLA-ABC antigen， negative for CD34、CD45 and HLA-DR. DMEM-F12 could promote the proliferation of quiescent cells. And the cells presented the better viability. Conclusion? Both of the two methods can produce hUCMSCs， DMEM-F12 medium is more suitable for the culture of hUCMSCs.

Key words： tissue adherence method; collagenase digestion method; human umbilical cord-mesenchymal stem cells（hUCMSCs）; culture medium; biological characteristics

目前較常用的人臍帶間充質干細胞（Human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUCMSCs）分離方法有組織塊貼壁法、酶消化法、流式細胞儀法、免疫磁珠法等，由于流式細胞儀法和免疫磁珠法對操作技術要求高，難免對細胞造成化學或機械損傷，影響細胞生物學特性，所以很少應用。最常用者為前兩種方法。不同的培養基對細胞的生長情況也有影響，目前常用的培養基有DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12等。本實驗將通過對照觀察兩種不同分離培養方法和三種不同培養基培養條件下的hUCMSCs的生物學活性，以期找到較適宜的hUCMSCs的培養方法和培養條件。

1? 材料和方法

1.1 材料：健康產婦新鮮臍帶（解放軍聯勤保障部隊第940醫院婦產科提供，產婦及家屬授權同意），DMEM-HG培養基、DMEM-LG培養基、DMEM-F12培養基（GIBCO公司，美國），胎牛血清（GIBCO公司，美國），膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）、MTT（Amresco公司，美國）、DMSO（Amresco公司，美國）

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質干細胞的培養

1.2.1.1 組織塊貼壁法：取新生兒臍帶置無菌生理鹽水，PBS充分洗滌至無血跡， 將其剪碎至碎泥狀后轉入培養皿，加入含10% FBS的DMEM-F12培養液，置于37℃、5%CO2培養箱培養。7d后，剔除組織塊首次換液。以后每2d換液1次，至貼壁細胞80%融合后傳代。

1.2.1.2 膠原酶消化法：開始同組織塊貼壁法，臍帶剪碎至碎泥狀轉移至1g/L膠原酶Ⅱ中，37℃恒溫振蕩儀持續消化30min后，隨即用1g/L胰酶37℃恒溫振蕩儀持續消化30min。以細胞篩過濾消化液，濾液1 500r/min離心10min，棄上清液以PBS洗2次。按照1.0×106/cm2的密度均勻接種于含DMEM-F12培養液（含10% FBS）的培養皿中。3d后首次換液，去掉未貼壁細胞。以后每2d換液1次，至貼壁細胞80%融合后傳代。

1.2.2 細胞消化傳代：棄去培養基，10% PBS沖洗3遍，加入胰蛋白酶（2.5g/L）和EDTA（0.2g/L）混合液（1：1）消化后可見細胞收縮變圓，即將脫離皿壁時棄消化酶，加2倍體積10% PBS終止消化，反復吹打混勻，1 000r/min離心10min棄上清液，加入新鮮培養基，以1：3～1：4比例細胞傳代，記P1，傳至P3代后， 細胞形態較為單一穩定。每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞的活力和生長情況，并適時照相。

1.2.3 流式細胞儀鑒定：取P3、P5、P7代hUCMSCs，棄培養基，1：1的2.5g/L胰蛋白酶（2.5g/L）和EDTA（0.2g/L）混合液（1：1）消化，以10% PBS洗滌3遍，制成濃度為3×105的單細胞懸液，每個Eppendof管加100μl細胞懸液，共6管。分別加入抗人CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PerCP、HLA-DR-FITC，HLA-ABC-FITC各10μl，室溫孵育30min，流式細胞儀檢測。

1.2.4 不同培養基對細胞的影響：以MTT法和計數板法檢測不同培養基對細胞增殖情況的影響：取第3代形態均一的細胞分別以DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12配置成密度為1×108/L的細胞懸液，以每孔0.2ml向96孔板接種，細胞處理組每板接種30個孔，2d換液，前9d每日每組取3個孔加入20μl MTT常溫孵育5h，棄去培養基加100μl二甲基亞砜常溫振蕩10min，酶標儀檢測吸光度值（492nm波長）;部分細胞分別以3×104/孔接種到24孔板中，每天各取3孔消化計數細胞。連續觀察9d，以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸繪制生長曲線。

1.2.5 觀察指標：MTT法和計數板計數法比較不同時間點3種培養基培養細胞的生長情況。

1.2.6 統計學分析：采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，以（x?±s）表示計量資料，運用單因素方差分析進行3組間比較，P<0.05為差異有顯著性意義。

2? 結果

2.1 不同分離方法的影響：用組織塊貼壁法分離培養hUCMSCs，7d左右可見散在的長條狀細胞（見圖1A）。棄組織塊，更換培養液，可見多個貼壁生長細胞集落。每個集落細胞數數量不等，形態與骨髓間充質極為相似，大為多角形或扁平狀的成纖維樣細胞。細胞透光度好，核仁明顯，胞體與骨髓MSC無明顯差異。1周后，每個細胞集落細胞數可達數百個，細胞形態大多漸變均一的紡錘形。2周左右90%細胞發生融合。此時以胰酶消化，按1：3的比例傳代，傳代后的細胞增殖迅猛，約每2d即可達到90%以上融合，需多次傳代或凍存。

用膠原酶消化法分離hUCMSC，第2天即看見有散在的條索狀貼壁細胞（見圖1B）。1周左右時，成纖維樣細胞貼壁并形成集落，偶見少量異常細胞集落，呈卵石樣，或為內皮細胞集落。成纖維樣細胞增殖能力強大，至2周左右可達到90%細胞發生融合。多次傳代后可得到形態均一穩定的成纖維樣細胞（見圖2）。傳代后的細胞形態無明顯變化，性質穩定，但多次傳代后細胞漸老化。

鏡下觀察發現傳代培養2～3d后細胞進入對數增長期。兩組細胞均生長旺盛，首次傳代時間平均為3～5d，傳代時間比較差異無顯著性意義（F=31.5，P>0.05）。兩種方法分離培養的細胞經過傳代后均生長較好，兩組細胞生長活性比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 細胞鑒定：用倒置相差顯微鏡可以觀察到較均一的長梭形或扁平形的成纖維樣細胞，折光度好，核仁明顯。隨著細胞迅速擴增，細胞集落呈現出典型的漩渦狀（見圖2）。經過2傳代，均可得到形態均一的細胞。流式鑒定其陽性表達CD29、CD44、HLA-ABC，陰性表達CD34、CD45、HLA-DR，證明是hUCMSCs。

2.3 不同培養基對生長的影響：分別以DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12 3種培養基培養第3代的hUCMSCs后，MTT法檢測發現較DMEM-LG和DMEM-HG而言，DMEM-F12組的A492nm明顯較高（見表1）。計數板法觀察到DMEM-F12組細胞提前發生倍增，細胞總量也最多（見圖3）。

3? 討論

2000年，Rrices[1]首次報道從臍帶血中可以分離培養出一種能夠分化為脂肪細胞和成骨細胞的多能干細胞，后來證實為hUCMSCs，隨后Mitchell等[2]研究發現，臍帶華爾通氏膠的基質細胞在體外培養能增殖80倍以上，能表達干細胞的標記包括c2kit（CD117）和端粒酶。提示可能有間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）存在于臍帶中，隨后有多位學者分別從臍靜脈內皮和內皮下、臍帶Whartons膠質和血管周圍組織中分離培養出了hUCMSCs，并初步建立了臍帶間充質干細胞的分離培養方法[3-5]。

各個實驗室采用多種方法進行hUCMSCs的分離培養，許多研究人員嘗試通過改變培養條件和改變培養基成分對間充質干細胞的擴增進行探索[6]，目前用于hUCMSCs的組織培養主要是臍帶華通膠和臍靜脈[7-8]，獲取方法主要有酶消化法[9]、組織塊法等。盡管組織塊法獲取細胞耗時過長，但這種方法獲得的細胞純度更高、且增殖率較高[10]。而且酶消化法耗材昂貴、操作技術要求高，耗時較長，難免對細胞造成化學和機械損傷。Iftimia-Mander等[11]研究亦表明酶消化臍帶分離出的MSCs，其細胞活性較組織塊法低。與此相比，組織塊法則簡捷，經濟，能夠更好地維持細胞活力并減少損傷機會，培養體系中避免了血細胞、血管內皮細胞或其他細胞的干擾。本實驗采用組織塊貼壁法與酶消化法分別成功獲得貼壁生長的hUCMSCs并形成集落和傳代擴增，且傳代后的細胞在數量與生長活性方面無明顯差異。

Romanov等[9]認為胎兒血液循環中富含hUCMSCs，并且隨著胎兒的成熟，大部分hUCMSCs定位于臍靜脈內皮下層和胎盤。這就部分解釋了臍帶富含MSCs的原因。本實驗研究發現，選擇培養足月產胎兒臍帶所hUCMSCs較多，這與Romanov的觀點相符合;在臍帶分離培養過程中注意無菌操作，在分離華通膠時剔除動靜脈血管以免內皮細胞混入;分離出的華通膠不必再經過消毒劑浸泡，因為可能會對hUCMSCs活性有影響。

hUCMSCs相對于其他細胞更脆弱，對環境敏感性更強，生長環境微弱的變化或許就會影響它的生長，因此必須選擇適宜的培養基。常用的培養有DMEM-LG，DMEM-HG，DMEM-F12 3種。文獻報道中常用DMEM-LG，但是細胞的首次傳代時間長，需要14d左右[12]，傳代細胞的生長周期也較長。但是本實驗發現DMEM-F12培養的hUCMSCs生長旺盛，細胞形態均一穩定，原代培養時間短（約10d），并且能保持hUCMSCs長期處于未分化狀態，這也許是因為與前兩者相比DMEM-F12含有較豐富的營養物質和微量元素。

總之，應用組織塊貼壁法與酶消化法都能夠得到純度較高的hUCMSCs，且不影響其生物學活性，但組織塊貼壁法操作更為簡捷、效率更高，是適宜的hUCMSCs分離方法。同時，DMEM-F12培養基可能較DMEM-LG、DMEM-HG培養基更適合于hUCMSCs的培養。

[參考文獻]

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[收稿日期]2019-07-18

本文引用格式：徐斌，劉毅.不同分離方法及培養條件對人臍帶間充質干細胞生物活性的影響[J].中國美容醫學，2020，29（2）：71-74.