MiR-197靶向JAK2調節人皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖侵襲能力的研究

[摘要]目的：探討miR-197通過調控JAK2對人皮膚鱗狀細胞癌細胞A431增殖和侵襲的影響。方法：收集2018年7月-2019年5月于筆者醫院經手術切除且被證實為皮膚鱗狀細胞癌的組織標本以及對應的癌旁組織標本各40例，RT-qPCR檢測miR-197在皮膚鱗狀細胞癌組織、癌旁組織、人正常皮膚細胞系HaCaT、人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC中的表達情況;Western-Blot檢測JAK2在各細胞株中的表達;生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-197和JAK2的靶向關系;MTS法檢測miR-197對A431增殖能力的影響;Transwell檢測miR-197對皮膚鱗狀細胞癌細胞侵襲能力的影響;IFA檢測miR-197對上皮間質轉化（EMT）相關分子N-cadherin表達的影響。結果：miR-197在皮膚鱗狀細胞癌組織和皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431中的表達水平分別高于癌旁組織和人正常皮膚細胞系HaCaT，差異均具有統計學意義（P<0.05）;與A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，穩定下調細胞系A431-miR-197-siRNA中miR-197、JAK2的表達水平均顯著下降（P<0.05）。經Target Scan數據庫分析發miR-197和JAK2有互補結合位點。下調miR-197能顯著降低皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲能力，同時抑制N-cadherin的表達水平。結論：下調miR-197能夠靶向抑制皮膚鱗狀細胞癌中JAK2的表達和降低EMT相關分子N-cadherin的表達，進而抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的EMT進程以及增殖侵襲能力。

[關鍵詞]miR-197;人皮膚鱗狀細胞癌;癌旁組織;HaCaT;JAK2;增殖;侵襲;上皮-間質轉化

[中圖分類號]R73? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）02-0074-05

Abstract： Objective? To investigate the effect of miR-197 on proliferation and invasion of human skin squamous cell carcinoma cell A431 by regulating JAK2. Methods? Forty specimens of skin squamous cell carcinoma and forty specimens of corresponding paracancerous tissues were collected from July 2018 to May 2019. The expressions of miR-197 in skin squamous cell carcinoma tissue paracancerous tissue， human normal skin cell line HaCaT， human skin squamous cell carcinoma cell lines A431， A431-miR-197-siRNA and A431-miR-197-siRNA-NC were detected by RT-qPCR. The expressions of JAK2 in various cell lines was detected by western-Blot.? The targeting relationship between miR-197 and JAK2 was verified by bioinformatics prediction and double luciferase reporter gene experiment. Effect of miR-197 on proliferation of A431 was detected by MTS. Effect of MiR-197 on the invasive ability of skin squamous cell carcinoma cells was detected by Transwell. Effect of miR-197 on the expression of N-cadherin， a molecule related to epithelial-mesenchymal transition （EMT） was detected by IFA. Results? The expressions level of miR-197 in skin squamous cell carcinoma tissue and skin squamous cell carcinoma cell line A431 were higher than that in adjacent tissue and human normal skin cell line HaCaT respectively， the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with A431 and A431-miR-197-siRNA-NC， the expression levels of miR-197 and JAK2 in the stably down-regulated cell line A431-miR-197-siRNA decreased significantly （P<0.05）. Analysis of Target Scan database showed that miR-197 and JAK2 had complementary binding sites. Downregulation of miR-197 could significantly reduce the proliferation and invasion ability of skin squamous cell carcinoma cells， and inhibit the expression level of N-cadherin. Conclusion? Downregulation of miR-197 could inhibit the expression of JAK2 and reduce the expression of EMT related molecule N-cadherin in skin squamous cell carcinoma， thus inhibiting the EMT process and proliferation and invasion ability of skin squamous cell carcinoma cells.

Key words： miR-197; human skin squamous cell carcinoma; paracancerous tissue; HaCaT; JAK2; proliferation; invasion; epithelial-mesenchymal transition（EMT）

皮膚鱗狀細胞癌（Squamous cell cancer，SCC）作為皮膚惡性腫瘤，好發部位為顏面、耳部、下唇和手背等曝光部皮膚，亦見于口腔黏膜、唇部、舌部及外陰等部位，成為整形外科常見疾病，該病起源于表皮和皮膚附屬器角質形成細胞，其發病機制復雜，尚無有效的治療措施[1-2]，因此深入研究SCC發生的分子機制，尋求可靠的靶向目標，已成為目前SCC基因治療的熱點。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一種具有調控功能的單鏈小分子，與腫瘤細胞的增殖、侵襲等密切相關[3]。有報道稱[4-5]miRNA-197直接參與器質性腫瘤如胃癌、肝癌的形成過程，但未有關于miRNA-197對SCC相關作用機制的報道。因此本研究通過對臨床和細胞實驗來探討miR-197對SCC細胞增殖的影響，以期為SCC的診斷和治療提供新的線索和靶向位點。

1? 材料和方法

1.1 組織標本：收集2018年7月-2019年5月于筆者醫院接受手術治療的40例SCC患者癌組織及其距離癌組織超過2.5cm處的正常組織，術前均未接受化療或者放療等治療措施。所有患者均同意本研究并簽署知情同意書，且經醫院倫理委員會審核批準展開。

1.2 細胞及主要試劑和儀器：人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431及人正常皮膚細胞系HaCaT（中國中科院細胞庫），下調miR-197的慢病毒載體siRNA及siRNA-NC（陰性對照）（上海吉瑪有限公司）。

FBS、RPMI1640培養基（TOYOBO）;Trizol 試劑盒（TaKaRa），MTS細胞增殖試劑盒、western blot試劑盒、Transwell試劑盒（美國BD公司）;反轉錄試劑盒（美國sigma公司）全蛋白抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），Lipofectamine-3 000轉染試劑、熒光素酶試劑盒（美國vector公司）;PBS緩沖液（美Amresco公司），青霉素（penicillin， peillin G，100u/ml），鏈霉素（streptomycin，STC，100μg/ml）（華北制藥廠）。Anti-JAK2抗體[4A6]（小鼠單克隆抗體[4A6] to JAK2，ab82539），山羊抗小鼠IgG H&L （HRP）（ab205719），Anti-N Cadherin抗體（兔多克隆抗體to N Cadherin，ab76057），山羊抗兔IgG H&L （Alexa Fluor? 647）預吸附二抗（山羊多克隆抗體二抗to兔IgG-H&L （Alexa Fluor? 647）預吸附二抗，ab150083）均購自Abcam。

蘇凈Airtech超凈工作臺（北京六一儀器廠），SANYO MCO-15AC細胞培養箱（美國強生公司）;Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡、電鏡（日本三菱公司）;Roche R480實時熒光定量PCR儀（美國Promega公司），Multiskan MK3酶標儀（美國Corning公司）。

1.3 RT-qPCR檢測組織和細胞中miR-197的表達：依據Trizol法提取皮膚鱗狀細胞癌組織、癌旁組織、人正常皮膚細胞系HaCaT、人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC樣本的總RNA，并進行反轉錄，按照PrimeScrip反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，所有操作嚴格按照試劑盒要求執行。采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：①預變性：75℃，120s;②變性：90℃，5min;③退火：60℃，60s;④延伸72℃，30s;⑤PCR儀采集熒光信號40個循環，U6作為內參（上游引物為5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物為5AACGCTTCACGAATTTGCGT-3），miR-197（上游引物為5-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3，下游引物為5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3），相對表達量用2-△△CT表示。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.4 Western-Blot檢測細胞中JAK2的表達：分別收集HaCaT、A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC細胞，用總蛋白提取試劑盒提取細胞中總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白樣品并進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉至PVDF膜，加含有5% BSA的封閉液室溫下封閉2h。分別加適量用封閉液稀釋的JAK2一抗，之后置于4℃冰箱過夜。次日用PBST將膜沖洗干凈，再分別加稀釋好的HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育2h，PBST洗膜，加ECL避光作用5min，暗室曝光拍照，同時以GAPDH作為內參蛋白。

1.5 生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因驗證miR-197和JAK2的關系：采用miR靶基因數據庫Target Scan預測MiR-197和JAK2的結合片段。采用PCR擴增含有miR-197、JAK2結合位點的JAK2片段，并將該擴增片段插入熒光素酶載體psi-CHECK中，構建野生型質粒并記為psi-CHECK-JAK2-wild，同時采用基因突變技術對結合片段中的核苷酸進行突變，并構建突變型質粒psi-CHECK-JAK2-mutant。將miR-197及陰性對照分別與野生型質粒psi-CHECK-JAK2-wild和突變型質粒psi-CHECK-JAK2-mutant共轉染至HEK293T 細胞。轉染后24h，根據雙熒光素酶檢測試劑盒說明書測定熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因活性。

1.6 MTS法檢測細胞增殖能力：調整細胞濃度，以5×103個/孔接種于96孔培養板中，輕輕混勻后，置入37℃，5% CO2培養箱常規培養，于轉染成功2d、3d、4d、5d后分別加MTS試劑20μl，37℃避光4h后，棄掉孔內液體，再加DMSO 100μl，置于37℃搖床上快速振蕩15min，以便充分溶解結晶物，最后將96孔板置于酶標儀上檢測 490nm處的OD值。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲：將40μl matrigel基質膠鋪于Transwell小室中，37℃靜置1h凝固后備用，實驗前12h棄原細胞培養液并換成無血清培養基，將細胞消化并用1×PBS清洗，細胞計數后取5×105細胞重懸，取200～250μl細胞懸液至Transwell小室中，下室加入500μl完全培養基，保證下層完全培養基與Transwell小室間無氣泡。置于培養箱內培養24h，4%多聚甲醛固定，PBS洗干凈，加0.1%結晶紫染液室溫避光染色15min，PBS漂洗后用棉棒擦Transwell小室內部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照并計數。

1.8 IFA檢測上皮間質轉化（EMT）相關分子N-cadherin：將A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC細胞消化后鋪至6孔板中，正常培養24h后棄培養基，加4%多聚甲醛固定10min，PBS沖洗后加0.1% Triton100通透15min，PBS沖洗，5% BSA的封閉液室溫封閉30min，分別加適量用封閉液稀釋的N-cadherin一抗，室溫孵育2h，PBS沖洗干凈，加稀釋好的熒光標記的山羊抗兔IgG二抗于37℃避光作用1h，用稀釋好的DAPI染細胞核，封片并置于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統計學分析：數據統計采用SPSS 19.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示具有統計學意義。

2? 結果

2.1 miR-197在組織和細胞中的表達：RT-qPCR結果顯示，皮膚鱗狀細胞癌組織中miR-197的表達水平高于癌旁組織，差異具有統計學意義（P<0.05）;人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431中miR-197的表達水平明顯高于人正常皮膚細胞系HaCaT，差異具有統計學意義（P<0.05）;穩定下調A431-miR-197-siRNA細胞系中miR-197的表達水平顯著低于A431和A431-miR-197-siRNA-NC，差異具有統計學意義（P<0.05），提示成功構建穩定下調miR-197的皮膚鱗狀細胞癌細胞株（見圖1）。

2.2 miR-197對JAK2表達的影響：Western-blot結果顯示，A431-miR-197-siRNA組中JAK2表達水平明顯下降，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，差異均具有統計學意義（P<0.05），后兩者之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。提示miR-197可正向調控JAK2的表達（見圖2）。

2.3 miR-197和JAK2關系預測及驗證：經www.microRNA.org網站預測發現miR-197和JAK2之間有互補結合序列，提示兩者具有靶向調控關系。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-197能顯著抑制野生型psi-CHECK-JAK2-wild的熒光素酶活性（P<0.05），而對突變型psi-CHECK-JAK2-mutant的熒光素酶活性無影響（P>0.05），提示MiR-197能特異性結合JAK2。見圖3。

2.4 miR-197對A431細胞增殖的影響：MTS實驗結果顯示，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC組相比，A431-miR-197-siRNA組細胞在3d、4d和5d時增殖能力明顯下降，差異有統計學意義（P<0.001）。提示下調miR-197的表達，可明顯抑制A431的細胞的增殖能力，見圖4。

2.5 miR-197對A431細胞侵襲能力的影響：Transwell小室結果顯示，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC組相比，A431-miR-197-siRNA組細胞通過matrigel基質膠的數量明顯減少，差異具有統計學意義（P<0.05）。提示下調miR-197的表達后，細胞侵襲能力明顯減弱，見圖5。

2.6 miR-197對EMT相關分子N-cadherin的影響：共聚焦顯微鏡觀察發現，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，A431-miR-197-siRNA組細胞中N-cadherin表達水平顯著下降，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖6。

3? 討論

SCC在非黑色素皮膚腫瘤中的發病率僅次于基底細胞癌，約占20%，好發于頭面部[6]，研究報道[7]稱吸煙、免疫抑制劑、化學致癌物質均為其發病的高危因素，但其發病機制尚不清楚，因此目前缺乏根治性的治療手段。已有研究證實[8]細胞內多種信號分子調控或者參與SCC細胞的發生及癌細胞的增殖，因此從分子基礎生物學角度出發尋找SCC靶向標志物，為患者提供有效的治療方法有著重要的意義。

miRNA近年來被證實對腫瘤細胞的生長周期、凋亡、腫瘤的浸潤轉移以及新血管生成等均發揮調控作用[9]。miR-197位于染色體lp13.3，Schulte等研究報道miR-197在子宮內膜癌中異常高表達[10]，Nan等[11]研究發現miR-197在肺腺癌中促進癌細胞的侵襲。目前尚無明確的報道研究miR-197的表達與SCC發生發展的關系。本研究發現，miR-197在皮膚鱗狀細胞癌組織和皮膚鱗狀細胞癌細胞株中呈高表達，提示其在皮膚鱗狀細胞癌發生發展過程中起著重要作用。此外，本研究成功構建了miR-197穩定下調細胞系，以進一步證實miR-197對皮膚鱗狀細胞癌細胞的影響及作用機制，結果顯示與A431和A431-miR-197-siRNA-NC組相比，下調miR-197的表達后，A431-miR-197-siRNA組細胞在3d、4d和5d時增殖能力明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。說明過下調miR-197的表達，可明顯抑制A431的細胞的能力，經Transwell實驗發現下調miR-197的A431細胞穿過matrigel基質膠的數量顯著減少，表明下調miR-197使腫瘤細胞侵襲能力明顯減弱。

[9]Abdelaziz AS.MiRNA directed cancer therapies： Implications in melanoma intervention[J].J Pharmacol Exp Ther，2018，364（1）：1-12.

[10]Kang X，Cao S，Ji Z，et al.miR-3646 promotes vascular inflammation and augments vascular smooth muscle cell proliferation and migration in progression of coronary artery disease by directly targeting RHOH[J].Int J Clin Exp Pathol，2018，11（12）：5830-5839.

[11]Nan Z，Liang T，Miao Z，et al.MicroRNA-197 induces epithelial–mesenchymal transition and invasion through the downregulation of HIPK2 in lung adenocarcinoma[J].J Genet，2018，97（1）：1-7.

[12]Mimura K，Teh JL，Okayama H，et al.PD-L1 expression is mainly regulated by IFN-γ associated with JAK-STAT pathway in gastric cancer[J].Cancer Sci，2018，109（1）：387.

[13]管玲男，劉哲，王歡，等.JAK/STAT3信號通路及其抑制劑在腫瘤治療領域的研究進展[J].中國藥學雜志，2018，53（23）：1973-1977.

[14]Chae YK，Chang S，Ko T，et al.Epithelial-mesenchymal transition （EMT） signature is inversely associated with T-cell infiltration in non-small cell lung cancer （NSCLC）[J].Sci Rep，2018，8（1）：2918.

[15]Li W，Liu J，Zou D，et al.Exploration of bladder cancer molecular mechanisms based on miRNA-mRNA regulatory network[J].Oncol Rep，2017，37（3）：1461-1468.

[收稿日期]2019-08-09

本文引用格式：趙思純.MiR-197靶向JAK2調節人皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖侵襲能力的研究[J].中國美容醫學，2020，29（2）：74-78.