異種牙本質修復兔顱骨缺損的實驗研究

葉嵐　王銀龍　陳玉成　袁紅春　殷保藏　徐建光

[摘要]目的：觀察異種牙本質修復兔顱骨骨缺損的療效，探索其作為骨移植替代材料的有效性。方法：將因正畸原因拔除的人健康前磨牙，制成直徑2～3mm的牙本質塊。在1%氯己定中浸泡5min。使用12只雄性健康新西蘭大白兔，在顱骨各建立4個臨界骨缺損，將自體骨、人牙本質隨機填入骨缺損區，術后4、8、12周隨機處死4只兔子，取出顱骨，通過大體觀察、Micro-CT及組織學觀察顱骨缺損修復情況，使用Micro-CT分析每個時間點新骨形成面積占骨缺損總面積百分比。結果：所有實驗動物傷口愈合良好，未見明顯炎癥反應。經影像學評估，自體骨比異種牙本質成骨量相似，且差異無統計學意義（P>0.05）。組織學染色示：圍繞在移植材料周圍，可見新骨形成。結論：異種牙本質能促進和加速骨缺損的修復，有望為促進骨缺損的修復提供一種新思路。

[關鍵詞]異種牙本質;骨缺損;兔顱骨缺損模型;新生骨;自體骨移植;Micro-CT

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）02-0082-03

Abstract： Objective? To investigate the effect of repairing skull defect with heterogeneous dentin in rabbits and the possibility as bone graft substitutes. Methods? Dentin blocks were prepared from human premolars that were extracted for orthodontic reasons. Dentin was processed into finer chips 2-3mm in diameter. The processed dentin was cleaned by socking them in 1% chlorhexidine for 5minutes.Bony defects were created on the heads of 12 male healthy NewZealand White rabbits. Four bony defects were created in each skull and randomly grafted with either human dentin blocks（experimental group） or autogenous bone grafts（control group）.Rabbits were sacrificed at 4、8 and 12 weeks. The general condition of rabbit was observed after operation， and bone defect repair was evaluated by Micro-CT at 4， 8 and 12 weeks. Then the tissue of defect area was harvested for histological staining to observe defect repair. Results? All animals survived to the end of experiment， and no incision infection occurred during repair process. Micro-CT demonstrated that the new bone volume were similar in the experimental group and the control group， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. The observation of histology staining indicated that the surface of the grafted materials were covered with new bone. Conclusion? Heterogeneous dentin accelerated bone regeneration and augmentation. These resultes suggested that heterogeneous dentin provided potential as a bone graft resource during the bone healing process.

Key words： heterogeneous dentin; bone defect; rabbit skull defect model; new bone; autogenous bone transplantation; Micro-CT

因機械外傷、腫瘤切除、感染、生理性吸收、先天性畸形等因素造成頜骨缺損骨量不足在臨床上很常見，成為制約種植技術發展和種植成功的重要原因[1]。因此如何增加骨缺損區的骨量是擴大種植牙適應證的關鍵因素。自體骨材料因其來源于自體，無免疫原性，植入后與宿主組織無免疫排異反應，而且具備骨移植材料的三大特性，包括骨生成性，骨傳導性和骨誘導性[2]，中等至嚴重的頜骨缺損自體骨移植技術被認為是可靠的和可預測的，因此認為自體骨是骨移植材料的金標準[3]。雖然自體骨移植有很多優點，但諸如患者不接受在第二術區（髂嵴，頦部）取骨所帶來的額外手術創傷、疼痛、出血及感染等;且受供區限制，取骨量少等缺點限制了自體骨的臨床應用[4]。因此，研究骨缺損修復材料具有重要意義。牙本質其物質組成及理化特性與骨組織相似[5-6]，使用牙本質修復兔顱骨骨缺損，以觀察其對骨缺損的修復能力。

1? 材料和方法

1.1 材料：3月齡，雄性健康新西蘭大白兔12只，體重約2.5kg;1%氯己定;瑞士Bio-Gide可吸收生物膜;因正畸原因拔除的人健康前磨牙若干（安徽醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科門診部提供）;高速手機;金剛砂車針;Micro-CT（SkyScan 1176，SkyScan，比利時）。

1.2 動物實驗

1.2.1 兔顱骨骨缺損模型的建立：將12只雄性健康新西蘭大白兔用3%戊巴比妥鈉按1.0ml/kg進行靜脈注射，麻醉后固定于手術臺，備皮，消毒。在顱底、兩耳之間向后作約5cm的切口，切開皮膚，皮下組織，肌層及骨膜，暴露顱骨，用球鉆在顱骨區制備4個直徑8mm的骨缺損（見圖1），同時用生理鹽水沖洗降溫。

1.2.2 移植材料制備：將收集到的臨床上因正畸原因拔出的人前磨牙，用高速渦輪機及金剛砂車針磨除牙釉質及牙骨質，去除髓腔內牙髓。用高速渦輪機等器械將其粉碎成直徑為2～3mm大小的顆粒，經1%氯已定溶液浸泡5min后，生理鹽水沖洗，分裝后備用。術中將取出的兔顱骨骨質磨成2～3mm的骨塊。

1.2.3 移植材料植入手術：快速將自體骨（對照組）、人牙本質塊（實驗組）各約1.5g隨機放入骨缺損區，覆蓋Bio-Gide膜，創口分層嚴密縫合。

1.2.4 術后處理：術后3d內每天肌肉注射40萬U青霉素預防感染。分別于術后4、8、12周行灌注處死4只大白兔，取出實驗樣本，置于10%中性福爾馬林固定液中固定。

1.3 觀察指標

1.3.1 大體形態觀察：術后密切觀察兔子的飲食、活動情況，傷口有無紅腫、溢膿。

1.3.2 放射學檢查：采用Micro-CT觀察新骨形成，將所有實驗樣本使用Micro-CT（SkyScan 1176）掃描，數據用Nrecon軟件重建，得到各個斷層的二維圖像。將重建后的數據導入CT analyser軟件，在每一截面選取目標區域，在目標區域內賦予新生骨合適的閾值，計算新生骨占骨缺損區的體積百分比，并創建3D模型，在CT vol中打開顯示三維效果。

1.3.3 組織學觀察：組織學標本經過常規固定、脫鈣、石蠟包埋，制作成5μm厚的組織學切片，進行HE染色分析。觀察缺損區修復情況。

1.4 統計學分析：采用SPSS 22.0軟件對所有數據進行處理，采用t檢驗，P<0.05時差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 大體形態觀察：術后1d所有兔子精神、飲食較差，無畏寒、發熱征象，手術傷口無紅腫、滲血現象。術后2～3d兔子精神、飲食、活動情況好轉，1周后恢復正常。所有兔子術后無感染、無動物死亡。術區大體觀察見圖2。

2.2 放射學檢查：Micro-CT結果表明：對照組與實驗組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。且隨著時間延長，新骨生成量增加。BV/TV比值（%）及統計學差異見表1。見圖3。

2.3 組織學觀察：組織學切片HE染色后，實驗組及對照組可見新骨形成，成骨細胞、纖維結締組織及新生骨組織圍繞移植材料分布。術后4周，移植物周圍可見少量炎細胞，少量新生骨形成;術后8周，圍繞移植材料周圍，成骨細胞增多，新生骨面積增大;術后12周，移植材料周圍可見大量新生骨組織，排列逐漸變得規則。實驗組染色結果見圖4。

3? 討論

目前，組織工程學中應用牙本質主要有以下四種形式[7]：①提取牙本質中的非膠原蛋白;②使用脫礦牙本質;③去除牙本質中的有機成分;④使用未改性牙本質如：凍干牙本質、液氮冷凍牙本質。有研究表明：牙本質脫礦增加了其在組織工程學應用中的優勢[8]。牙本質脫礦有利于生長因子及蛋白質釋放從而有利于骨誘導性[9]。但1998年有報道顯示部分脫礦牙本質顆粒未見骨誘導性[10]。在脫礦過程中最重要的是防止蛋白質變性。有研究表明，去除牙本質有機成分形成的變性牙本質會降低自身的機械強度[11]，使其不能很好的應用于承受應力的骨組織區。因此，未脫礦及變性的牙本質應用也是非常重要的。

在動物實驗及臨床試驗中，均有將牙本質植入牙槽嵴缺損區，后在缺損區行種植的報道。如：Frank Schwarz教授利用自體牙根部牙本質作為骨增量材料，在8只獵狐犬上進行實驗，12周后，埋入種植體，結果顯示牙槽嵴增量高度、種植體與骨結合率良好[12]。對1名32歲女性患者，使用拔除的牙根制成牙本質后，行牙槽嵴骨增量手術，24周后進行種植。結果顯示了良好的骨生成以及種植體的穩定[13]。

本實驗采用人牙本質移植至兔顱骨。牙本質周圍未見明顯炎癥反應，說明牙本質的免疫原性反應不是主要因素。牙齒的免疫原性與軟組織、牙周韌帶和牙髓有關，在本實驗中，牙本質被用于移植前，牙髓等軟組織均被去除。研究中沒有發現明顯異種移植的免疫原性反應，這也為牙本質的異體和異種移植成功開辟了可能[14]。牙本質可以從因正畸原因拔除的第三磨牙或前磨牙或其他途徑中獲得。

牙本質內具有骨誘導性，在植入骨缺損中能夠融合并逐漸被骨取代，很可能是因為牙本質中含有骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）[15]。目前，對BMP的臨床應用是一個熱點，問題是為BMP尋找一個載體，可使BMP緩慢釋放，且載體本身不應引起任何炎癥反應[16]。

綜上，本實驗采用異種牙本質修復兔顱骨骨缺損，經體內觀察，發現其生物相容性良好，驗證了其具有促進骨缺損修復的能力，有望為促進骨缺損修復提供新的思路。對于如何處理牙本質以增加其骨誘導性及骨傳導性，還需要更進一步的研究。

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[收稿日期]2019-07-31

本文引用格式：葉嵐，王銀龍，陳玉成，等.異種牙本質修復兔顱骨缺損的實驗研究[J].中國美容醫學，2020，29（2）：82-84.