石斛合劑對高脂高糖糖尿病大鼠心肌細胞Ca2+代謝的影響

王海生，謝永財，李長征，林 鑫，陳佳林

（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州350122）

糖尿病心肌病（diabetic eardiomyopathy，DCM）早期以心肌舒張功能障礙為主，晚期則以心肌收縮功能障礙為主，最終引起各種心律失常、心力衰竭、心源性休克，甚至猝死，其發病原因可能是心肌細胞的代謝紊亂、鈣穩態失衡、冠狀動脈的微血管病變、心肌間質纖維化以及心臟自主神經病變。Ca2+作為心肌啟動興奮-收縮和復極-舒張兩個偶聯的樞紐，在正常心肌細胞內存在相對穩定的鈣平衡系統，即鈣穩態。鈣穩態失衡，Ca2+信號失常，可導致心肌收縮、舒張功能受損。石斛合劑以滋陰、益氣、活血立法，具有良好的降糖、降脂作用，可有效預防2 型糖尿病的并發癥［1］。 本研究以糖尿病心肌病大鼠模型為研究對象，以肌漿網Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a）、L 型鈣通道αlC亞單位蛋白（calciumchannel，voltage-dependent，L type，alpha lC subunit，CACNA1C）為指標，探討石斛合劑對糖尿病心肌病Ca2+代謝的影響，為石斛合劑治療DCM 提供佐證。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 Wistar 大鼠，SPF 級，體質量（150±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，合格證編號：2015000 532211。

1.2 實驗藥物 石斛合劑藥物組成：石斛12 g，黃芪20 g，太子參15 g，丹參20 g，葛根20 g，五味子15 g。 購自福建省第三人民醫院，自煎，濃縮至生藥含量2.0 g／mL，滅菌分裝后保存備用。 鹽酸二甲雙胍腸溶片，每片250 mg，購自貴州天安藥業股份有限公司，批號：20160769。

1.3 實驗試劑 高脂飼料（閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司）；鏈脲佐菌素（上海源葉生物科技有限公司，CAS 號：18883-66-4）；SERCA2a 一抗（美國Abcam 公司）；CACNA1C 一抗（Bioss 公司）；HRP 標記山羊抗兔二抗、β-actin、GAPDH（美國Proteintech公司）；Trizol 試劑盒、cDNA 一鏈合成試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.4 實驗儀器 NanoDrop 2000 分光光度儀（美國Thermo 公司）；9700 基因擴增儀（美國Applied Biosystems 公司）；水平電泳儀、GelDoc XR 凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；Rt2100c 酶標檢測儀（美國Rayto公司）；DYCZ-24DN 雙垂直電泳儀、DYCZ-40D 轉印電泳儀（北京六一儀器廠）；V300 掃描儀（日本EPSON 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 選取Wistar 大鼠24 只，于福建中醫藥大學SPF 級實驗動物中心分籠飼養，每籠5 只。 適應性喂養1 周后，隨機取5 只作為正常組，予基礎飼料喂養7 周后，腹腔注射2 mL 檸檬酸緩沖液，1 周內注射2 次。 余19 只大鼠采用高脂高糖飼料喂養聯合鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病心肌病模型［2-3］，以高脂飼料喂養7 周后，腹腔注射鏈脲佐菌素15 mg／kg，1 周內注射2 次。 注射鏈脲佐菌素1 周后，測空腹血糖，血糖值11.1 mmol／L 以上確定為糖尿病模型。 成模大鼠隨機分成3 組，即模型組、二甲雙胍組、石斛合劑組，繼續予高脂飼料喂養。 成模8 周后，二甲雙胍組按80 mg／（kg·d）予二甲雙胍溶液灌胃；石斛合劑組按6.9 g／（kg·d）予石斛合劑煎液灌胃；正常組、模型組予相同體積生理鹽水灌胃。 每周灌胃5 次，4 周后，用10%水合氯醛，以0.4 mL／kg 的劑量腹腔注射麻醉，剪取左心室，冷凍備用檢測。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 大鼠血糖檢測 實驗結束前，禁食不禁水12 h，麻醉后，腹主動脈采血，檢測血糖水平。

2.2.2 大鼠心肌病理學觀察 取左心室組織經梯度酒精脫水、二甲苯透明，浸蠟，包埋制成蠟塊，切成厚度為5 μm 的切片，HE 染色光鏡觀察。

2.2.3 大鼠心肌細胞內游離鈣濃度測定 參照BEUCKELMANN 等［4］方法進行改良，采用熒光分光光度計法測定心肌細胞內游離鈣（calcium in cardiomyocyte，MyoCa2+）。 取100 mg 心室肌組織，熒光分光光度計測定細胞懸液熒光F（激發波長340 nm，發射波長500 nm），加入0.1%Triton X100 和2.5 mmol／L 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），測定最大熒光值（Fmax）和最小熒光值（Fmin），計算MyoCa2+濃度。

2.2.4 RT-PCR 法測定SERCA2a mRNA 水平 取左心室游離壁組織100 mg，提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA 濃度， 確定RNA 的純度及濃度，A260／A280應在1.8～2.0 之間。 cDNA 合成及PCR擴增按南京諾唯贊生物科技有限公司的cDNA 一鏈合成試劑盒和PCR Mix 說明書操作。引物由上海博尚生物技術有限公司合成，SERCA2a（rat）上游引物：5’CTATGACTGGTGATGGTGTGAAC-3’，下游引物：5’GGAGATGAGGTAGCGGATGA-3’，擴增片段長度203 bp；GAPDH（rat）上游引物：5’ACGGCA AGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物：5’GAAGACG CCAGTAGACTCCACGAC-3’，擴增片段長度110 bp。使用美國Applied Biosystems 9700 PCR System，按預變性（94℃，5 min）、變性（94℃，30 s）、退火（58 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，20 s；2→4，30 個循環；72 ℃，7 min）程序，進行擴增。 取4 μL PCR 擴增產物，經0.9%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀檢測條帶灰度值。

2.2.5 Western blot 檢測SERCA2a 和CACNA1C 蛋白表達 取左心室游離壁組織100 mg，冷PBS 洗滌置于勻漿管中，加入蛋白酶抑制劑，進行勻漿、離心，收集上清液。 采用BCA 法測定蛋白濃度，蛋白變性后，通過SDS-PAGE 電泳及轉膜，TBST 配制的5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入SERCA2a 一抗（1∶1 000）和CACNA1C 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PVDF膜用TBST 洗滌3 次，加入二抗（1∶10 000），室溫下搖床上孵育1 h。 以ECL 試劑盒顯色，在顯影儀中觀察相應蛋白表達量，Image-J 軟件分析目標帶的光密度值。

2.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。 實驗數據以（x±s）表示，符合正態分布用方差分析，非正態分布用秩和檢驗中獨立樣本比較。

3 結 果

3.1 4 組大鼠血糖比較 見圖1。

圖1 4 組大鼠血糖比較

3.2 大鼠心肌HE 染色結果 正常組心肌細胞形態正常，心肌纖維排列整齊；模型組心肌纖維排列紊亂，纖維增粗、斷裂明顯；二甲雙胍組心肌纖維增粗，排列尚整齊，纖維斷裂較多；石斛合劑組心肌纖維排列較整齊，增粗不明顯，纖維斷裂較少。 見圖2。

圖2 4 組大鼠心肌HE 染色光鏡圖（×400）

3.3 4 組大鼠心肌細胞MyoCa2+含量比較 見圖3。

圖3 4 組大鼠心肌細胞MyoCa2+含量比較

3.4 4 組大鼠心肌SERCA2a mRNA 表達比較 見圖4。

圖4 4 組大鼠心肌SERCA2a mRNA 表達比較

3.5 4 組大鼠心肌SERCA2a 蛋白表達比較 見圖5。

3.6 4 組大鼠心肌CACNA1C 蛋白表達比較 見圖6。

4 討 論

臨床研究認為，糖尿病的病機始于痰濕阻滯、痰瘀熱積，繼而傷陰（夾瘀），引發糖耐量異常和2 型糖尿病，日久傷陰耗氣致氣陰兩虛和陰陽兩虛，而且多夾雜瘀血［5］。 根據此特點，按照滋陰、益氣、活血的治療原則，創立了由石斛、黃芪、太子參、丹參、葛根、五味子組成的石斛合劑，獲得了良好的臨床效果［1］。

圖5 4 組大鼠心肌SERCA2a 蛋白表達比較

圖6 4 組大鼠心肌CACNA1C 蛋白表達比較

心肌細胞鈣循環主要包括鈣釋放、鈣回攝和鈣儲存三個過程，任何一個環節的異常都將破壞心肌細胞的鈣穩態，引起細胞內鈣瞬變減小或衰減減慢，是心力衰竭時心肌收縮力下降的主要原因。 心肌細胞去極化時，肌漿網內少量Ca2+通過L 型鈣通道迅速進入細胞質使得Ca2+濃度增加，Ca2+與肌漿網上的蘭尼堿受體2 結合使其開放，導致大量的鈣離子從肌漿網中釋放出來，此過程即鈣誘導鈣釋放［6］。 糖尿病心肌病時，L 型鈣通道表達過量，導致細胞質內的Ca2+濃度過高，造成鈣超載，使興奮收縮偶聯加強，心肌收縮力增強，最終引起舒張功能障礙［7］。 本研究CACNA1C 蛋白定量結果顯示，石斛合劑組和二甲雙胍組比較，差異雖然無統計學差異（P＞0.05），但同模型組比較，石斛合劑組CACNA1C 表達顯著降低（P＜0.05），說明石斛合劑可以抑制CACNA1C蛋白表達，具有一定抑制CICR 的作用。

心肌細胞收縮后，鈣離子的清除主要經肌漿網鈣泵即SERCA2a［8］，將細胞質內的Ca2+回攝至肌漿網內儲存，SERCA2a 在鈣回攝中具有主導作用。 一般認為，糖尿病時SERCA2a 活性降低，攝取Ca2+速率減慢［9］，導致細胞質Ca2+增多，造成鈣超載，心肌收縮時間延長［10］。 本研究中SERCA2a mRNA 及蛋白表達結果顯示，石斛合劑組與正常組之間差異無統計學意義（P＞0.05），但同模型組與二甲雙胍組比較，均呈顯著性增高（P＜0.05），說明石斛合劑可以增加SERCA2a mRNA 和蛋白表達，提升攝取Ca2+的速率，降低細胞質Ca2+負荷，緩解鈣超載。 MyoCa2+測定也顯示，石斛合劑組心肌細胞內游離鈣較模型組顯著性較低（P＜0.01），同二甲雙胍組比較明顯降低（P＜0.05）。心肌HE 染色光鏡觀察結果同樣顯示，石斛合劑組心肌纖維排列明顯較模型組、二甲雙胍組整齊，纖維斷裂也極少發生。

石斛合劑對心肌細胞的保護作用，除了糾正鈣穩態失衡之外，是否降糖作用也是途徑之一？ 但血糖值對比顯示，石斛合劑組與模型組比較，有明顯降糖作用（P＜0.05），但不及二甲雙胍組（P＜0.05），說明石斛合劑保護心肌細胞的作用不在于降糖作用。

綜上所述，石斛合劑對心肌細胞保護的途徑在于抑制CACNA1C 表達，減緩鈣誘導鈣釋放，防止肌漿網內的Ca2+過多過快的進入細胞質；更重要的是通過促進SERCA2a 表達，增加肌漿網鈣泵對鈣的回攝，起到防止心肌細胞鈣超載，有效預防糖尿病心肌病的發生。