炎癥微環境對人乳牙牙髓干細胞促破骨相關因子表達的影響

張靈芝

（合肥市口腔醫院；安徽醫科大學合肥口腔臨床學院，安徽 合肥230001）

隨著組織工程學的發展，干細胞領域一直是學者關注的熱點問題，干細胞較強的自我更新能力和定向分化潛能在組織工程中發揮著重要的作用[1]。人乳牙牙髓干細胞是一種間充質干細胞，是再生醫學的理想細胞來源，它們具有最小的致癌風險、高增殖能力、高多向性和免疫抑制能力，研究表明人乳牙牙髓干細胞移植對小鼠肝纖維化具有抗纖維化作用[2]。另有學者研究發現，乳牙牙髓干細胞與乳牙牙根生理性吸收的過程息息相關[3]，異常的乳牙牙根吸收會導致乳牙早失或乳牙滯留，乳牙牙髓干細胞在維系牙齒正常萌出的過程中有著重要的作用。

炎性微環境是牙髓疾病最常發生的一種病理狀態，嚴重影響著牙齒的健康，流行病學調查顯示，中國兒童口腔衛生狀況日趨嚴峻，罹患牙髓炎的患兒日趨增多，因此炎癥這種病理狀態是否會對乳牙牙根吸收造成影響？本實驗對炎性微環境下人乳牙牙髓干細胞促破骨細胞相關因子的表達進行了檢測，探索了炎癥對乳牙牙根吸收的影響，從而解釋了臨床上乳牙早失的原因之一。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、實驗儀器

主要試劑、實驗儀器如表1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材

乳牙牙髓組織取材于合肥市口腔醫院兒童口腔科門診就診的6～8歲兒童即將脫落的乳切牙，取材前征得家屬同意，要求兒童無全身系統性疾病，牙髓牙周組織健康。

表1 主要試劑、實驗儀器

1.2.2 細胞培養

酶消化結合組織塊法培養乳牙牙髓細胞，用含雙抗的PBS反復沖洗牙根冠表面，用無菌探針取出新鮮的牙髓組織放在預冷的含有雙抗和PBS比例為1∶100的PBS中，反復沖洗干凈后轉移到無菌培養皿中用手術刀輕輕分割牙髓組織。1000r/min離心5min。棄上清后，加入含1∶1的3mg/mLI型膠原酶和4mg/mLDispase酶混合液1mL，37.5℃每隔5min振蕩，消化70min，加入少量胎牛血清終止消化。離心后棄上清，加入2mL的α-MEM培養液（含10%胎牛血清），將其置于CO2培養箱（5%CO2，37℃恒溫）中孵育，每隔1d換液。待細胞匯集80%后采用有限稀釋法克隆分離培養，待克隆集落形成后正常消化傳代培養。

1.3 實驗分組

將乳牙牙髓細胞分為正常組和實驗組，正常組細胞用含有5%胎牛血清的α-MEM培養液培養，實驗組細胞用培養液含終濃度為10ng/mL的TNF-α培養。

1.4 成骨、成脂誘導

將第三代細胞接種于6孔板內，待細胞匯合至60%～70%時，更換成骨、成脂誘導液，每隔3d換液，分別誘導3周后，當出現鈣化結節和脂滴時停止誘導，茜素紅進行成骨染色，油紅進行成脂染色。

1.5 Real-timePCR檢測兩組細胞TRAP、CTSK基因表達

將正常組和對照組的牙髓細胞用TRIzol裂解，提取RNA，經逆轉錄為cDNA。引物設計由上海生工生物有限公司設計合成，引物序列如表2所示。

表2 引物序列

1.6 統計學分析

使用SPSS22.0軟件進行統計分析，各實驗數據均采用均數±標準差（x±s）表示，組間差異單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 人乳牙牙髓細胞的培養與純化

用酶消化+組織塊法培養原代細胞，3d左右組織塊周圍有牙髓細胞貼壁爬出，原代培養的牙髓干細胞如圖1所示。通過有限稀釋法挑選細胞，培養7d左右，可見細胞呈束狀排列，實驗選用細胞狀態良好的第三代細胞作為研究對象，第三代牙髓干細胞如圖2所示。

圖1 原代培養的牙髓干細胞

圖2 第三代牙髓干細胞

2.2 乳牙牙髓干細胞的多向分化能力

牙髓干細胞經過21d成骨、成脂誘導后，用配置好的茜素紅溶液以及油紅O溶液分別對其進行染色，結果顯示成骨誘導組出現鈣化結節，如圖3所示。成脂誘導組出現脂滴，如圖4所示，表明乳牙牙髓干細胞具有間充質干細胞多向分化的能力。

圖3 成骨誘導21d后茜素紅染色

圖4 成脂誘導21d后油紅染色

2.3 炎癥微環境對乳牙牙髓干細胞促破骨細胞形成的影響

用TNF-α模擬炎癥微環境，以10ng/mL濃度的TNF-α刺激人乳牙牙髓干細胞，分別檢測對照組與實驗組促破骨細胞相關因子的表達情況，realtimePCR檢測結果顯示TNF-α刺激組破骨細胞特異性蛋白TRAP、CTSK的表達明顯上升，分別如圖5、圖6所示，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5刺激組TRAP表達明顯上升

圖6刺激組CTSK表達明顯上升

3 討論

替牙期兒童牙列處于乳恒牙交替的過程之中，乳牙根的生理性吸收對于恒牙的正常萌出至關重要，不同的外界微環境會對乳牙牙根吸收產生影響。本實驗檢測了炎癥微環境下破骨細胞特異性蛋白TRAP、CTSK的表達，結果顯示，炎癥微環境能促進破骨細胞形成增加，可能會導致乳牙根的病理性吸收。

骨重建包括骨吸收和骨形成兩個階段，兩個階段通常是平衡的。當骨吸收超過骨形成時，會導致骨質破壞等病理過程。組織蛋白酶K是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶家族的一員，通過活化破骨細胞高表達[4]，研究表明，CTSK通過降解骨基質中的I型膠原調節骨吸收；在牙源性角化囊腫、成釉細胞瘤、牙周炎中，骨吸收機制可能與CTSK相關[5]，在病理狀態下，CTSK活性增強，導致骨質的破壞與降解，而抑制CTSK的表達可以減少樹突狀細胞和T細胞的浸潤和炎性細胞因子的產生，緩解了牙周炎病變區的骨質破壞[6-7]。本實驗檢測了炎癥微環境中乳牙牙髓干細胞中CTSK的表達，結果顯示，與對照組相比，CTSK的表達明顯上升，提示骨吸收活性增強，也有學者研究發現IL-1α可通過NF-KB信號通路激活破骨細胞中CTSK的過度表達，引起牙周炎等骨吸收疾病。本實驗僅檢測了破骨細胞特異性蛋白TRAP、CTSK基因表達的水平，在一定程度上證明了炎癥微環境能促進破骨細胞形成增加，但通過何種分子機制調控了這一現象的發生，還有待后續的研究。