循環microRNA檢測在骨質疏松發生中的研究進展

徐月新

江蘇省蘇北人民醫院婦產科，江蘇揚州225001

骨是一個連續的動態平衡組織，通過持續骨形成與骨吸收來維持其礦化平衡及自身完整結構。一旦成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收的平衡狀態被打破，就會引發骨質疏松、骨硬化癥等骨病［1］。骨質疏松(osteoporosis)是最常見的與年齡關聯的骨代謝紊亂疾病，主要表現為骨量丟失、骨微環境改變及骨結構退化，導致骨骼脆性增加和骨折發生風險增加。骨質疏松通常沒有明顯的臨床癥狀，一般在骨折發生后才被發現［2］。隨著人類壽命延長和臨床大肆使用糖皮質激素，骨質疏松這個“隱性的殺手”正折磨著近一半的中國老年群體，他們中發生骨折的比例高達33%［3］。絕經后骨質疏松是原發性骨質疏松中最常見的類型。目前骨質疏松的發病機制尚未完全闡明，深入研究其分子特征對其診斷和治療具有重要意義。骨質疏松的早期診斷比較困難，因此迫切希望探索一種靈敏度高、特異性好、方便性佳的新型生物標志物進行骨質疏松早期篩查和診斷。

1 循環microRNA的概述

循環非編碼RNA含量豐富、性質穩定和無創性，作為血液來源的生物標志物具有潛在的應用價值，可以提供腫瘤生物信息及治療效果，比如靶向治療和免疫療法［4］。miRNA是研究最為廣泛的一類非編碼RNA，一般長度約為21個核苷酸，miRNA大概占人類基因組的1%，并在幾乎所有組織中高度保守。自上世紀90年代發現miRNA以來，已經鑒定出超過2 500種miRNA，幾乎參與了所有生物學過程，包括細胞分化、增殖、凋亡和組織發育等。miRNA就像激素分子通過旁分泌或內分泌影響細胞行為，miRNA在細胞聯系中發揮作用［5］。

成熟miRNA的形成最初由細胞核中基因組DNA轉錄生成初始轉錄物(pri－miRNA)，Drosha/Dgcr8酶復合物將其剪切成含有60～75個核苷酸的發卡結構前體 RNA(pre－miRNA)，轉運蛋白exportin5將其轉運至細胞質，經過Dicer酶(RNase III核酸內切酶)作用進一步加工形成 dsRNA－miRNA復合體。雙鏈打開后其中一條鏈通常與靶mRNA 3'UTR結合形成“RNA誘導的沉默復合體(RISC)”，導致mRNA的裂解或翻譯阻斷，而與其互補的另一條單鏈則被降解［6］。每個miRNA可以調控多個(甚至上百個)靶基因，而特定靶mRNA也可以同時被多個miRNAs調節。最初認為miRNA通過促進mRNA降解或通過結合靶基因3'UTR抑制RNA翻譯來負調控靶基因的表達。但miRNA作用靶位不僅是mRNA的非編碼區，還能與mRNA的編碼區作用，而且miRNA可以通過抑制翻譯起始、延長、提前終止翻譯及偶聯翻譯蛋白來調控蛋白翻譯過程［7］。自2007年發現成熟miRNA可以以外泌體和微小囊泡形式或結合相關蛋白形成復合物釋放到細胞外液中，就像信號分子一樣在細胞間交換遺傳信息［8］。2010年Weber發現miRNA可以穩定存在于多種體液中，如血液、唾液、眼淚、尿液、羊水、乳汁、支氣管分泌物、腦脊液、腹膜液、胸膜液和精液［9］。

目前研究證明循環miRNA表達譜的變化與多種腫瘤的發生、發展具有明確的相互關系，如血漿或血清中特異表達的miRNA可用于胰腺癌的診療。基于循環miRNA靈敏性高、特異性強、穩定性好、技術便捷快速的優勢，可以將其作為腫瘤臨床診斷和預后評估的生物標志物。在骨骼疾病研究中，盡管已經發現miRNA調控骨形成/骨吸收重建過程、骨細胞生長、分化及功能的機制，但目前大部分miRNA研究基于細胞實驗和動物模型。少量文章提及循環miRNA改變和骨質疏松骨折相關，所以循環miRNA在骨質疏松的診斷作用及療效有待進一步研究。分析血清和尿液中生物標志物不僅可以反映成骨細胞和破骨細胞的酶活性，而且可用于研究骨代謝信號通路及骨骼疾病如骨質疏松的變化。生物標志物一方面有助于研究骨代謝機制，另一方面幫助臨床醫生確定患者骨折的高風險，并監視抗骨吸收治療及骨形成制劑的治療效果［10］。循環miRNA檢測為骨質疏松發生發展機制研究提供理論基礎，并有望為骨質疏松的預防和治療提供新的靶點，并為骨質疏松的早期診斷、輔助診斷提供新的生物標志物。

2 miRNA與骨質疏松發生相關

目前關于miRNA調控骨質疏松機制的研究大多局限于細胞及動物模型水平。近年來研究發現，與骨代謝相關基因的選擇性表達會導致骨質疏松及其他骨骼疾病的發生，miRNA通過調控骨發育相關基因的表達，包括關鍵的轉錄因子、骨發育信號通路相關分子及其受體等，影響骨的形成與發育［1］。條件性摘除成骨細胞、軟骨細胞和破骨細胞中Dicer酶，影響miRNA的生成，導致胚胎致死及細胞礦化能力喪失，證明miRNA在正常骨骼發育和骨穩態中是必不可少的［11］。

2.1 miRNA介導成骨細胞調控骨質疏松發生

成骨細胞是介導骨形成的重要細胞，其增殖、分化及活性改變直接影響骨骼重建。成骨細胞由間充質干細胞分化而來，此過程受一些細胞外信號和轉錄因子的精細調控。目前調控成骨細胞分化的細胞外信號主要有 BMP、Hedgehog、Notch、WNT 和FGF［1］。Liu 等［12］發 現 在 骨 髓 間 充 質 干 細 胞(BMSC)成骨分化中miR－338－3p表達減少，而在卵巢摘除小鼠中其表達增加，并通過體外實驗證實miR－338－3p靶向Runx2和Fgfr2抑制了成骨細胞分化，推測miR－338－3p可以作為骨質疏松潛在的調控子。而miR－188在老齡小鼠和老年人BMSC中表達顯著升高，如果在小鼠骨髓中抑制miR－188的表達，則骨量丟失情況好轉，但miR－188轉基因小鼠骨量丟失嚴重。在老齡小鼠中特異抑制BMSC中miR－188的表達，會促進骨形成和抑制脂肪積累。miR－188是BMSC向成骨分化和成脂分化轉換的關鍵調控子，是年齡相關的骨量丟失的潛在治療靶點［13］。基于miRNA在成骨分化過程和疾病發生及發展中起著如此重要的作用，miRNA在骨質疏松治療過程中可作為潛在靶點。

2.2 miRNA介導破骨細胞調控骨質疏松發生

破骨細胞是介導骨吸收的重要細胞，其增殖、分化及活性直接影響骨量改變。骨吸收過度會導致骨平衡被打破，進一步引起骨質疏松發生。研究發現如果BMSC缺乏FasL蛋白，會減少破骨細胞凋亡發生，導致骨吸收過度，進一步發生骨質疏松。雌激素能促進FasL蛋白聚集，同時雌激素缺乏會引起miR－181a表達增加。雌激素可以通過抑制BMSC中miR－181a的表達來維持骨平衡［14］。而老齡大鼠BMSC及其外泌體中miR－31a－5p表達顯著增加，miR－31a－5p能促進破骨分化和骨吸收。如果減少老齡大鼠中miR－31a－5p的表達，其破骨細胞活性下降且骨量丟失好轉。miR－31a－5p可能成為與年齡相關的骨質疏松潛在的治療靶點［15］。Krzeszinski等［16］研究發現miR－34a轉基因小鼠表現出低骨吸收和骨量增加，且卵巢摘除誘導的骨質疏松和乳腺癌等骨轉移情況都明顯減少。通過轉基因、藥理及疾病模型試驗，證實miR－34a是關鍵的破骨細胞抑制子，并為骨骼保護、防止骨質疏松發生及改善腫瘤骨轉移提供治療策略。miR－141是破骨形成和骨吸收關鍵的抑制子，靶向Calcr和EphA2抑制破骨細胞生成和骨吸收。在老齡猴子和骨質疏松患者骨頭中miR－141低表達，通過核酸傳輸系統選擇性在破骨細胞中高表達miR－141，發現老齡猴子骨量丟失情況好轉，且其他身體行為及器官功能未受影響［17］。研究表明老齡婦女的骨折及卵巢摘除小鼠的骨量減少，與破骨細胞和血清外泌體miR－214－3p高表達相關。在miR－214－3p轉基因小鼠中，血清外泌體miR－214－3p表達增加，骨量減少，而拮抗miR－214－3p表達后骨量得到恢復。在卵巢摘除小鼠中抑制破骨細胞來源的外泌體miR－214－3p的表達能促進骨形成［18］。miRNA在抑制骨吸收中發揮重要作用，為臨床應用miRNA治療骨質疏松提供可靠的實驗依據。

3 循環miRNA檢測在骨質疏松發生中的意義

3.1 循環miRNA與先天性骨質疏松

Wnt信號通路是骨平衡中常見的信號通路之一，其配體Wnt1突變，會引起嚴重的先天性骨質疏松及骨折。在p．C218GWnt1位點突變家族中，針對12例位點突變的骨質疏松患者及其對照血清，檢測了192種 miRNA，發現 miR－18a－3p 和 miR－223－3p表達上升，而 miR－22－3p、miR－31－5p、miR－34a－5p、miR－143－5p、miR－423－5p 和 miR－423－3p 表達下降。其中 miR－22－3p、miR－34a－5p和 miR－31－5p是Wnt信號通路抑制子，miR－22－3p和 miR－34a－5p靶向結合 Wnt1 mRNA，miR－31－5p靶向結合Wnt1 3’UTR。提示 Wnt1突變破壞了這些miRNA和Wnt1的反饋調節，闡明了Wnt相關骨骼疾病的發病機理，預示這些miRNA可作為診斷、治療骨質疏松潛在標志物［19］。Feichtinger等［20］在 36例先天性骨質疏松患者中，研究19種血清miRNA標志物和骨微結構及骨組織形態的關系，發現4種miRNA和骨微結構相關，7種miRNA和骨組織形態相關。miR－29b－3p、miR－324－3p和 miR－550a－3p表達明顯和骨形成的組織形態參數相關，而在抗骨吸收治療患者中miR－29b－3p和miR－324－p表達下降。該文章首次報道血清水平上骨相關miRNA可以替代骨組織形態測定，反映骨微環境的改變。

3.2 循環miRNA與骨質疏松骨折

由于骨質疏松往往沒有明顯的臨床的變現，一般發生了骨折后才進一步確診為骨質疏松。近些年不少研究通過研究骨質疏松骨折案例，試圖找尋新的早期診斷及治療靶點。Seeliger等［21］運用miRNA芯片分析30例骨質疏松髖骨骨折患者的血清樣本，其中83種miRNA有差異表達，而9種miRNA(miR－21、miR－23a、miR－24、miR－93、miR－100、miR－122a、miR－124a、miR－125b、miR－148a)在骨質疏松患者血清中表達增高。另外20例骨質疏松病人骨組織樣本中，6種 miRNA(miR－21、miR－23a、miR－24、miR－25、miR－100、miR－125b)表達增高，其中5種miRNA在骨質疏松患者血清及骨組織中均增高，提示這些miRNA可作為診斷生物標志物和治療骨量丟失、改善骨折愈合的治療靶點。Chen等［22］對比15例骨質疏松骨折病人及12例對照骨關節炎病人的血清，發現 179例 miRNA中 3種 miRNA(miR－122－5p、miR－125b－5p、miR－21－5p)表達顯著上升，miR－21－5p的表達和骨吸收標志物CTx相一致，提示一些miRNA尤其是miR－21－5p，可作為骨折生物標志物。

Weilner等［23］研究發現在老年及骨質疏松患者血漿中miR－31表達增加，內源miR－31由衰老細胞分化的微泡分泌而來，靶向Frizzled－3抑制成骨分化。證明老年人血漿中微泡miR－31在與年齡相關的且受損的骨形成過程中重要作用。而在7例股骨頸骨折的骨質疏松婦女血清樣本中發現6種miRNA表達顯著差異，其中 miRNA－10a－5p、miRNA－10b－5p和 miRNA－22－3p表達上升，而miRNA－133b、miRNA－328－3p 和 let－7 g－5p 表達下降。進一步擴大血清樣本證實miR－22－3p、miR－328－3p和let－7 g－5p調控成骨細胞分化，并發現骨質疏松患者中差異表達的循環miRNA和骨代謝相關的原因［24］。在骨質疏松髖骨骨折患者血清中發現6種miRNA表達改變，其中 miR－144－3p靶向RANK調控破骨細胞生成，影響破骨細胞形成、增殖和凋亡［25］。Mandourah 等［26］對納入研究的 139 例患者進行miRNA芯片分析，發現差異表達的miRNA，并在139例血清樣本及134例血漿樣本中進行驗證。發現循環miR－122－5p和miR－4516在非骨質疏松對照、骨量減少及骨質疏松患者中明顯差異表達。深入研究發現這些miRNA表達水平和骨質疏松患者的脆性骨折及低骨密度密切相關。

3.3 循環miRNA與絕經后骨質疏松

絕經后骨質疏松是骨質疏松中最常見的類型，近些年對絕經后骨質疏松婦女的血樣、骨組織及相關治療中miRNA進行研究，尤其是循環miRNA(表1)。Dickkopf－1(DKK1)是經典Wnt信號通路強拮抗劑，是骨質疏松的生物標志物，其表達和骨量及成骨細胞成熟相關。卵巢摘除大鼠模型中miR－433－3p和miR－106b表達異常，而循環血清中DKK1和循環 miR－433－3p相關，miR－433－3p靶向作用DKK1誘導成骨細胞分化，在DKK1/Wnt/β－catenin信號通路中發揮重要作用［27］。通過卵巢摘除大鼠篩選出了15種差異表達的血清miRNA，進一步驗證發現絕經后骨質疏松婦女中miR－30b－5p顯著下降，miR－103－3p、miR－142－3p和miR－328－3p表達明顯上升。證實這些miRNA可能作為無創檢測絕經后骨質疏松中的生物標志物［28］。

Ramírez－Salazar等［29］運用 RT－PCR 技術分析20例骨質疏松病人及其對照血清中754種miRNA的表達，發現 miR－23b－3p、miR－140－3p和 miR－885－5p存在倍數變化，隨后分別在28例骨量減少、26例骨質疏松及21例髖骨骨折患者血清進行驗證，認為miR－23b－3p和 miR－140－3p可作為絕經后婦女骨質疏松潛在生物標志物。對81例絕經后骨質疏松婦女(51～62歲)及74例健康絕經前婦女(40～46歲)進行 miRNA表達譜分析，發現 miR－27a在骨質疏松患者中下降最為顯著。在人和鼠中分離出的間充質干細胞中抑制或過表達miR－27a，可以誘導細胞向成骨細胞或脂肪細胞分化［30］。

循環單核細胞分化成破骨細胞，可以調控骨代謝。Wang 等［31－32］首次在循環單核細胞中進行miRNA表達分析，并確定絕經后骨質疏松新的生物標志物。選取高骨密度及低骨密度的絕經后的歐洲婦女各10例進行miRNA芯片篩選及qRT－PCR驗證，發現miR－133a和miR－422a在低骨密度婦女中顯著升高。進一步在20例絕經后婦女中進行miR－133a及其潛在靶基因(CXCL11、CXCR3、SLC39A1)的皮爾森關聯系數分析，而破骨形成相關基因是miR－422a靶基因。同時發現在絕經后骨質疏松患者外周血循環單核細胞中miR－503表達顯著下調，過表達 miR－503抑制其靶基因 RANKL表達，RANKL能誘導破骨形成，而抑制miR－503可以促進破骨形成。在卵巢摘除小鼠中抑制miR－503會增加RANKL蛋白表達，促進骨吸收，導致骨量減少。人循環單核細胞(即破骨細胞前體細胞)中miRNA在絕經后骨質疏松發生中發揮重要作用，是潛在的生物標志物并有望成為新的治療途徑［33］。

針對120例絕經后中國婦女(根據全髖骨骨密度分為3組:正常骨量、骨量減少、骨質疏松)進行血漿樣本中 miR－21、miR－133a和 miR－146a的檢測。在骨量減少及骨質疏松組中miR－21表達下降，miR－133a表達上升，而3組血漿中miR－146a表達沒有明顯差異。同時對循環miRNA表達和骨密度進行關聯分析。證實在骨質疏松及骨量減少患者中差異表達的miRNA與骨密度結果相關聯［34］。Kocijan等［35］為了研究先天性及絕經后骨質疏松人群中循環miRNA表達，檢測了187種miRNA并發現存在循環miRNA顯著差異表達，3組(絕經前、絕經后、男性)中 19種 miRNA(miRNA－152－3p、miRNA－335－5p、miRNA－320a、let－7b－5p、miRNA－7－5p、miRNA－16－5p、miRNA－19a－3p、miRNA－19b－3p、miRNA－29b－3p、miRNA－30e－5p、miRNA－93－5p、miRNA－140－5p、miRNA－215－5p、miRNA－186－5p、miRNA－324－3p、miRNA－365a－3p、miRNA－378a－5p、miRNA－532－5p、miRNA－550a－3p)表達水平相一致，8 種 miRNA(miR－152－3p、miR－30e－5p、miR－140－5p、miR－324－3p、miR－19b－3p、miR－335－5p、miR－19a－3p、miR－550a－3p)比骨密度及骨標志物能更好鑒別出骨質疏松患者，且不受年齡和性別的限制。尤其miR－29b－3p先前已報道是成骨分化調控子，可作為骨質疏松患者新的標志物。在74例絕經后婦女血漿樣本中發現 let－7 d－5p、let－7e－5p、miR－30 d－5p、miR－30e－5p、miR－126－3p、miR－148a－3p、miR－199a－3p、miR－423－5p 和 miR－574－5p差異表達，并進行miRNA表達和患者骨密度測量、骨折風險評估的關聯分析［36］。Yavropoulou等［37］研究低骨量和絕經后婦女中調控骨代謝的特異miRNA血清水平，血清分離出14種miRNA并發現低骨量患者血清中miR－124和miR－2861表達明顯升高，而 miR－21、miR－23和 miR－29表達明顯降低。而脊椎骨折的骨質疏松婦女中miR－21－5p表達顯著降低，研究證實miR－21－5p在區分脊椎骨折婦女中具有66%敏感性及77%特異性。提示miRNA是敏感的絕經后骨質疏松血漿和血清標志物。

表1 循環miRNAs參與絕經后骨質疏松發生Table 1 MicroRNAs involved in postmenopausal osteoporosis

更多的研究深入探索miRNA或者miRNA聯合是否可以區分不同骨折類型的狀態，一般絕經后骨質疏松和骨量丟失有關，而糖尿病骨病一般呈現正常骨密度水平，但易發生骨折。Heilmeier等［38］的研究首次發現miRNA和糖尿病絕經后婦女的脆性骨折相關，通過miRNA－qPCR芯片發現48種miRNA在糖尿病骨折婦女中存在表達差異，而 23種miRNA在絕經后骨質疏松骨折婦女中表達差異，18種miRNA在糖尿病骨折婦女及絕經后骨質疏松骨折婦女中都表達差異。3種miRNA(miRNA－96－5p、miRNA－181－5p、miRNA－550a－5p)在糖尿病骨質疏松骨折中特異表達上升，2種miRNA(miRNA－188－3p和miRNA－942)在絕經后骨質疏松骨折中表達下降。4種miRNA在區分糖尿病骨折方面具有高度特異性和敏感性。針對低骨量的絕經后婦女服用抗骨質疏松藥物特立帕肽(teriparatide，TPTD)或狄諾塞麥(denosumab)進行研究，發現TPTD治療3個月和12個月后 miR－33－3p表達明顯下降，TPTD治療12個月后骨密度和miR－124－3p水平負相關。TPTD治療中miR－24－3p和miR－27a表達和骨標志物相關，而狄諾塞麥治療中miR－21－5p、miR－23a－3p、miR－26a－5p、miR－27a、miR－222－5p、miR－335－5p和骨標志物相關。證明TPTD和狄諾塞麥治療明顯影響循環 miRNA表達［39］。循環miRNA可以作為糖尿病骨病潛在生物標志物及治療靶點。

4 結論

血液來源的生物標志物往往具有無創性，可以監測腫瘤生長及療效，已經成為臨床研究和實踐過程中的必要手段。患者的高效管理依賴于疾病的早期診斷及療效監測。miRNA轉錄水平或miRNA分泌水平的特異改變都和骨骼疾病的發生及發展密切相關。目前已經報道循環miRNA在骨關節炎、骨質疏松及骨折患者中研究，都發現miR－133a在不同人種絕經后骨質疏松婦女中表達增高，而miR－21表達降低。說明循環miRNA作為骨生物標志物具有巨大潛力，但不同的研究也會發現同一種miRNA在骨生物學研究結果大相徑庭，這可能是miRNA本身調控骨代謝的復雜性導致的。

總而言之，這些研究雖然證實了循環miRNA作為骨生物標志物的價值，但在臨床研究、常規開展及個體化用藥方面，需進一步實驗研究，確保miRNA能反映骨形成和骨微結構的動態變化，使循環miRNA檢測更具臨床實用性，成為篩查、診斷及治療骨質疏松的堅實可靠的手段。