單環刺螠Urechisunicinctus幼體腸道消化酶活性的測定方法

楊成林 林淦旻 常林瑞 劉學遷 劉峰 趙彥翠

摘 要：探究了單環刺螠（Urechis unicinctus）幼體（平均體重（1.468 ± 0.222）g）腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的測定方法、操作步驟、注意事項。蛋白酶測定采用Folin-酚法，其中建立的酪氨酸回歸方程為y=15.487x-0.092 3（決定系數R2=0.999 2）;淀粉酶測定采用淀粉-碘比色法，以0.08%的淀粉溶液為底物。脂肪酶測定采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法（NaOH滴定法）。結果表明，單環刺螠幼體腸道蛋白酶活力、淀粉酶、脂肪酶活力分別為29.350±2.592、10.600±0.844、（5.266±0.224）U/mg prot。

關鍵詞：單環刺螠（Urechis unicinctus）;腸道;蛋白酶;淀粉酶;脂肪酶;測定方法

中圖分類號：S917.4

單環刺螠（Urechis unicinctus）俗稱海腸、海腸子，屬于螠蟲動物門（Echiurioidea），螠綱（Echiurida），無管螠目（Xenopneusta），刺螠科（Urchidae）、刺螠屬（Urechis），適應能力強，挖“U”型洞穴，棲息于泥沙岸潮間帶下區和潮下帶淺水區泥沙底質，棲息地廣泛分布于俄羅斯、朝鮮半島、日本和中國的黃渤海沿岸[1]。作為名貴的海鮮產品，單環刺螠具有極高的開發養殖前景。單環刺螠味道鮮美，營養豐富，體壁肌含有豐富的蛋白質以及人體需要的氨基酸，具有極高的營養價值，被譽為“裸體海參”。單環刺螠體內存在速激肽[2]、抗凝血肽[3]等多種生物活性肽，這些生物活性肽具有抗菌、抗腫瘤及提高小鼠免疫力等功能[4]，因此單環刺螠還是一種具有潛在藥用價值的海洋無脊椎動物。隨著單環刺螠育苗技術的突破，單環刺螠的規?；绾宛B殖在遼寧大連、山東煙臺等地也日漸展開。單環刺螠的消化道結構簡單，主要包括食道、嗉囊、砂囊、胃、腸道等，其中腸約占消化道長度的60%，并且細胞內有大量的泡狀結構和線粒體，可以認為中腸是單環刺螠物質吸收的主要場所[5-6]。目前關于單環刺螠消化酶的研究較少。許星鴻等[7]通過Folin-酚法、淀粉-碘比色法、NaOH滴定法，采用正交實驗設計，研究了不同鹽度、pH及溫度對單環刺螠成體（平均體重為（71.2±8.5）g）腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影響。但是許星鴻等[7]的研究并沒有具體詳細的測定方法，同時目前關于單環刺螠幼苗腸道消化酶的研究也未見報道。單環刺螠的規模化育苗和養殖的發展，離不開餌料/飼料的開發，而消化酶活力研究有助于了解單環刺螠對餌料/飼料中基本營養成分的消化能力，為其篩選餌料/飼料原料提供依據。本研究探索單環刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性的測定方法、操作步驟及注意事項，研究單環刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，以期為單環刺螠人工餌料/飼料的開發提供基礎研究方法。

1 材料與方法

1.1 粗酶液的制備

取實驗室養殖單環刺螠30頭，平均體重為（1.468±0.222）g（平均值±標準差）。10頭一組，隨機分成3組。每一組用解剖工具在冰盤上將單環刺螠的腸道完整取出，用濾紙吸干腸表面的水分，稱重，10頭混成一個樣品（分別為樣品1、樣品2、樣品3），按樣品重量與體積比為1∶9加入0.85%的生理鹽水在冰浴條件下進行研磨，研磨后將勻漿液進行離心（4 ℃，4 000 r/min），所得上清液就是粗酶液，將粗酶液在液氮中速凍后，轉移到-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 粗酶液蛋白濃度的測定

樣品粗酶液的蛋白濃度采用考馬斯亮藍試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。根據試劑盒說明書的步驟進行實驗操作，每個樣品設置兩個平行樣進行測定，每個樣品的結果取兩次平行的平均值。樣品粗酶液中蛋白濃度的單位換算為mg prot/mL。

1.3 蛋白酶活性的測定——福林-酚法

本實驗采用福林-酚法[8]測定單環刺螠腸道蛋白酶活力，Folin-酚試劑是磷鎢酸（H3O40PW12）與磷鉬酸（H3PO4·12MoO3）混合試劑，在pH值大于7的情況下極其不穩定，被酚類化合物還原而成藍色（鎢蘭與鎢蘭的混合價態的藍色化合物）。蛋白質中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸），因此可用蛋白酶水解酪素生成酚基氨基酸的呈色反應來間接測定蛋白酶活力。本實驗使用的福林試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3.1 實驗主要試劑

0.02 M pH值7.5磷酸緩沖液、0.5 M NaOH溶液、0.5%酪素。

0.5%酪素的配制：稱取酪蛋白0.5 g以0.5 M NaOH 1 mL潤濕，加入60 mL 0.02 M pH 7.5磷酸緩沖液稀釋后在熱水浴中不斷攪拌至完全溶解。待完全冷卻后，轉移至100 mL容量瓶，再用0.02 M pH7.5的磷酸緩沖液定容（冰箱可保存一周）[9]。

1.3.2 酶活力的測定

1.3.2.1 酪氨酸標準曲線制作

1.3.2.1.1 主要試劑及配制

1 mol/L鹽酸、0.55 M Na2CO3 溶液、10%三氯乙酸、100.0 μg/mL 酪氨酸標準溶液。

100.0 μg/mL 酪氨酸標準溶液：精確稱取L-酪氨酸0.050 0 g（105 ℃干燥至質量恒定），用1 mol/L鹽酸溶液30 mL溶解后用50 mL容量瓶定容，即為1.00 mg/mL 酪氨酸標準溶液。吸取1.00 mg/mL 酪氨酸標準溶液10.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液（將1 mol/L鹽酸溶液稀釋10倍即得0.1 mol/L鹽酸溶液）定容至100 mL容量瓶，即可得到100.0 μg/mL L-酪氨酸標準溶液。

1.3.2.1.2 L-酪氨酸標準曲線的繪制

用100.0 μg/mL L-酪氨酸標準溶液，配制系列濃度的L-酪氨酸溶液（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL），配制方法見表1。取10 mL離心管，分別取上述系列濃度的L-酪氨酸溶液1.00 mL，各加5.00 mL 0.55 M Na2CO3 溶液，再各加入1.00 mL福林試劑，放入37 ℃恒溫水浴鍋中水浴顯色15 min，用分光光度計于波長680 nm[10]，以A管為空白管調零（表1），分別測定吸光值，每個系列濃度做兩個平行，OD值取兩個平行的平均值。

以反應液吸光度OD680為橫坐標（表1），以各管反應液中酪氨酸的實際濃度為縱坐標（表1），繪制標準曲線并計算回歸方程（圖1）。

1.3.2.2 實驗樣品的測定 實驗設置1個對照組與3個樣品測定組，對照組和每個測定組分別設兩個平行，吸光值取兩個平行的平均值。反應用具蓋的離心管以便混勻與離心，粗酶液稀釋40倍后用于測定，測定步驟如表2。完全混勻后，置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴顯色15 min后，于680 nm波長處以對照組校零，讀取樣品測定組吸光值。利用繪制的酪氨酸標準曲線回歸方程計算出酪氨酸濃度后，進行蛋白酶活力的計算。

1.3.2.3 注意事項 酶液與底物的作用溫度、作用時間要嚴格控制，否則將對實驗結果有較大的影響。在正式實驗之前，對于同一樣品，通過預實驗確定粗酶液需要稀釋的倍數，以保證實驗樣品的吸光值在酪氨酸標準曲線范圍內。

1.4 淀粉酶活性的測定——淀粉-碘比色法

淀粉-碘比色法的原理在于淀粉經淀粉酶水解后的產物與碘液可形成藍色包合物[10]。分析淀粉酶活力有助于研究與分析其腸道對不同食物來源的淀粉的消化能力[11]。

1.4.1 主要試劑的配制

0.08%可溶性淀粉：精確稱取可溶性淀粉0.20 g，用蒸餾水約10 mL溶解，充分攪拌使其成淀粉懸液，完全轉移至250 mL容量瓶中，再用蒸餾水定容。淀粉懸液可在0～4 ℃冰箱內保留一周（最好現配現用）。

0.1 M碘貯存液：準確稱取碘化鉀（KI）11.25 g及碘酸鉀（KIO3）0.891 7 g置于500 mL燒杯中，加入200 mL蒸餾水，待完全溶解后緩慢地加入2.25 mL濃鹽酸，混勻后轉入250 mL容量瓶中，再用蒸餾水定容。置于冰箱中備用。

0.01 M碘應用液：量取0.1 M碘貯存液20 mL，用蒸餾水稀釋至200 mL（200 mL容量瓶定容），貯存于棕色瓶中。可在0～4 ℃冰箱內保存約一個月。

1.4.2 實驗樣品的測定 實驗設置1個對照組和3個樣品測定組，每組分別設置兩個平行，吸光值取兩個平行的平均值。取10 mL離心管，標注對照組與測定組，粗酶液稀釋10倍后用于測定，具體操作步驟見表3[12]。立刻混勻。用蒸餾水校零，于660 nm波長處測定吸光值。

1.4.3 注意事項 當淀粉酶含量較多或活性較高時，因淀粉被淀粉酶全部水解而不顯色，故可根據反應顯色程度，通過預實驗，調整淀粉濃度、粗酶液稀釋倍數及使用量。此外，淀粉溶液較為穩定，故對照組的吸光值不會改變，因此在測定中不用每次都設置對照組。反應后出現藍色沉淀，因而測定時須將溶液混勻后再進行測定，否則將影響實驗結果。

1.5 脂肪酶活性測定方法——聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法（NaOH滴定法）

聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定單環刺螠脂肪酶活性的原理為天然油脂被水解后而生成的游離脂肪酸可以被NaOH中和，反應式為RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O，故可根據消耗的NaOH溶液的量間接測定脂肪酶的活性[13-14]。測定單環刺螠腸道脂肪酶活力有助于研究與分析其腸道對不同食物來源中的脂肪的消化能力。

1.5.1 主要試劑的配制

0.025 M pH值7.5磷酸緩沖液、0.05 M 標準NaOH溶液、4%聚乙烯醇橄欖油乳化液、1% 酚酞。

4%聚乙烯醇橄欖油乳化液：稱取10 g聚乙烯醇顆粒（天津市光復精細化工研究所，平均聚合度為1 750±50）放入500 mL燒杯中，加入250 mL蒸餾水，過夜溶脹，一邊加熱（80～90 ℃）一邊不停攪拌至完全溶解，最后用三層紗布過濾，濾液備用。量筒量取4%聚乙烯醇溶液150 mL，加入50 mL分析純橄欖油，用磁力攪拌器攪拌至呈乳白色，即為聚乙烯醇橄欖油乳化液，存于4 ℃冰箱內待用（3天內使用）。

1% 酚酞：稱取1 g酚酞粉末溶于60 mL無水乙醇中，完全轉移至100 mL容量瓶中并用無水乙醇定容至100 mL。

1.5.2 實驗樣品的測定 取50 mL燒杯若干，分別為樣品對照組與樣品測定組，每組設兩個平行，結果用兩個平行的平均值表示，測定使用原始粗酶液，具體操作方法見表4。用0.05 M標準NaOH溶液滴定至微紅，并記錄使用的NaOH溶液的體積。

1.5.3 注意事項 在加入95%乙醇時要不停攪拌，否則會產生絮狀物影響實驗結果。加入95%乙醇是為了終止反應停止酶作用和溶解脂肪酸，故在樣品測定組加入95%乙醇時要快速，以保證反應時間相同。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶活力

蛋白酶比活力單位定義：每毫克組織蛋白在37 ℃下每分鐘水解酪素而產生的1 μg酪氨酸為一個蛋白酶活力單位，單位為U/mg prot。

蛋白酶比活力（U/mg prot）=A20÷（取樣量×待測樣本蛋白濃度稀釋倍數）

式中：A表示根據樣品的吸光值通過回歸方程計算，得出的相應酪氨酸的微克數;20表示反應時間為20 min;取樣量為酶反應時所取的酶液的體積，本實驗中酶液的使用量為1 mL;稀釋倍數是指反應酶液相對于原始粗酶液的稀釋倍數，本實驗中稀釋倍數為40倍[15]。

測定結果見表5，單環刺螠腸道蛋白酶活力為（29.350±2.592）U/mg prot。

2.2 淀粉酶活力

淀粉酶比活力單位定義：每毫克組織蛋白在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉，定義為1個淀粉酶活力單位，單位為U/mg prot。

淀粉酶比活力（U/mg prot）=（對照組OD值-測定組OD值對照組OD值×0.8×0.510×30 min7.5 min÷（取樣量×待測樣本蛋白濃度（mg prot/mL）稀釋倍數）

式中：0.8為1 mL 淀粉溶液中含有淀粉0.8 mg;0.5為反應體系中加入淀粉溶液的體積0.5 mL;10表示是10 mg 淀粉;稀釋倍數是指反應酶液相對于原始粗酶液的稀釋倍數，本實驗中稀釋倍數為10倍。

測定結果見表6，單環刺螠幼體腸道淀粉酶活力為（10.600±0.844）U/mg prot。

2.3 脂肪酶活力

脂肪酶比活力單位定義：在pH值7.5與40 ℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘水解脂肪所產生1 μmol脂肪酸定義為一個脂肪酶活力單位，單位為U/mg prot[15]。

脂肪酶比活力（U/mg prot）=（樣品測定組NaOH溶液用量-樣品對照組NaOH溶液用量）×50t÷（取樣量×待測樣本蛋白濃度（mg prot/mL）稀釋倍數）

式中：（測定組NaOH溶液用量-對照組NaOH溶液用量）單位是 mL;50表示消耗0.05 mol/L 的NaOH 1 mL 相當于反應體系產生脂肪酸50 μmol（GB/T 23535-2009脂肪酶制劑）;t表示反應時間，本實驗中反應時間為20 min;稀釋倍數是指反應酶液相對于原始粗酶液的稀釋倍數，本實驗中使用的是原始粗酶液，故稀釋倍數為1倍。

測定結果見表7，單環刺螠腸道脂肪酶活力為（5.266±0.224）U/mg prot。

3 分析與討論

消化酶是維持機體正常代謝的生命活性物質，可以催化生物體內各種生化反應，從消化酶活性的大小可以得出機體對營養物質的消化吸收能力，根據其消化對象的不同，可以分為蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等幾種。消化酶活性的測定方法多種多樣，不同的研究人員，不同的實驗條件往往所采用的標準及定義不同，而且不同的動物都有其特異性。因此對于消化酶研究相對匱乏的單環刺螠，針對消化酶活性測定方法的詳細操作方法、注意事項的研究尤為重要。本實驗所測定的單環刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力，在反應溫度、反應時間、反應pH值等反應條件下都需要準確把控，否則會對實驗產生較大的影響[7，16]，同時需要仔細開展預實驗摸索合適的取樣量，密切關注酶活測定過程中的注意事項，才能保證數據的可信性。

水產動物消化酶活力受不同養殖環境條件如養殖溫度、鹽度、pH值的影響[7，17-19]，尤其是養殖環境溫度對水產動物消化酶活性影響最為明顯[17-19]。本實驗中所用的單環刺螠幼體（平均體重（1.468±0.222）g）養殖條件為溫度15～18 ℃，鹽度28‰～30‰，pH為7.8～8.0，投喂飼料為配合飼料（粗蛋白質含量為46.80%，粗脂肪含量為7.66%）。本實驗測得單環刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為29.350±2.592、10.600±0.844、（5.266±0.224）U/mg prot。目前，對單環刺螠消化酶活性的研究很少。許星鴻等[7]研究了不同養殖條件（pH、溫度和鹽度）對單環刺螠成體（平均體重（71.2±8.5）g，投喂飼料為小球藻和中肋骨條藻）腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響。許星鴻等[7]研究表明在養殖條件為溫度15 ℃，鹽度30 ‰，pH為8的情況下，單環刺螠成體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為4.42±0.31、16.10±1.08、（3.87±0.47）U/mg prot;養殖條件為溫度20 ℃，鹽度35 ‰，pH為8的情況下，單環刺螠成體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為17.34±1.25、13.38±0.39、（7.46±0.63）U/mg prot。雖然許星鴻等[7]研究中的養殖條件與本實驗的養殖條件接近，酶活的測定方法也一致，但是由于飼料的成分對水產動物消化酶活性有較大影響[20-22]，所以很難進行單環刺螠幼體和成體腸道蛋白酶、消化酶、脂肪酶活性的比較。

隨著對單環刺螠腸道各類消化酶測定的相關研究不斷深入，對其消化酶活力的了解會越來越清晰，可以進一步掌握單環刺螠對食物不同成分的消化吸收能力，為其天然飼料的選擇、人工飼料各類成分的配比和適宜養殖條件的確定提供理論基礎，使其不僅可以提高蛋白質和淀粉的利用率，又可以減少糞便中的氮、磷排放量，這樣不僅充分利用飼料、節約資源，又能減輕水體污染，因此單環刺螠消化酶研究將有助于單環刺螠的規?；B殖。

4 結論

本實驗詳細探究了單環刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的測定方法、操作步驟、注意事項，為單環刺螠生物學及飼料開發研究中消化酶的測定提供基礎參考。在此實驗方法的指導下測得投喂配合飼料的單環刺螠幼體（平均體重（1.468±0.222） g）腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為29.350±2.592、10.600±0.844、（5.266±0.224）U/mg prot。

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Abstract：The determination methods， operation steps and precautions for operation methods of intestinal protease， amylase and lipase activity in juvenile Urechis unicinctus （average weight （1.468 ± 0.222）g） were explored in detail. The intestinal protease， amylase and lipase activity in juvenile Urechis unicinctus was respectively determined by method of Folin-phenol， starch-iodine colorimetry and hydrolysis of polyvinyl alcohol emulsion of olive oil （titration of NaOH）. In order to determine the intestinal protease activity assay in juvenile Urechis unicinctus， the established regression equation of tyrosine was y = 15.487 x - 0.0923 （R2 = 0.999 2）. The intestinal protease activity in juvenile Urechis unicinctus was （29.350 ± 2.592）U/mg prot. The intestinal amylase activity was （10.600±0.844）U/mg prot with 0.08% starch solution as substrate. The intestinal lipase activity was （5.266±0.224）U/mg prot.

Key words：Urechis unicinctus; intestinal tract; protease; amylase; lipase; determination method