基于網絡藥理學探討紅花治療非酒精性脂肪肝的可能性*

鄧 楠，樊姝寧，徐 甜，程發峰，王雪茜，王慶國

（北京中醫藥大學，北京 100029）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指以除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與肥胖、高血糖、高脂血癥關系密切，是造成慢性肝病、肝功能異常的主要原因之一[1]。目前全球流行病學調查表明，NAFLD在全球的發病率為10%～30%，亞洲國家平均為11%～16%，中國的患病率約15%，且逐步呈低齡化趨勢[2-3]。盡管近年來NAFLD的發病率持續增加，但臨床上仍缺乏公認的對NAFLD具有明顯療效的藥物治療。目前的主要治療方法是以調節血脂作為輔助治療，同時改變生活方式、健康飲食和規律運動，從而促進脂肪減少以減緩NAFLD病程進展，然而效果并不理想[4]。

中醫藥治療NAFLD結合辨證與辨病的特點，治療方法多樣，在一定程度上可以有效阻止病情的發展。紅花為菊科植物紅花的干燥花，性溫，味辛，歸心、肝經，具有活血通經，祛瘀止痛的功效。實驗研究表明紅花注射液的使用提高了高脂血癥的治療有效率，縮短了治療時間[5]。同時，紅花提取物可以降低血漿黏度，減少氧自由基，降低脂蛋白對血管內皮細胞損傷程度從而提高其抗氧化能力[6]。表明紅花具有降血脂、減輕氧化應激的作用。因此，筆者推論紅花可以治療NAFLD。研究利用網絡藥理學研究方法，篩選出紅花的活性成分，挖掘出其治療NAFLD的多靶點與多通路，為闡明紅花治療NAFLD提供參考。

1 方法

1.1 紅花所含化學成分的收集與篩選 本研究采用中藥系統藥理數據庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“紅花”為關鍵詞，檢索紅花的化學成分共計189個。生物利用度是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）特性中最重要的藥物代謝動力學參數之一。口服是中藥在胃腸道發揮作用的最主要途徑，因此本研究主要以紅花中化合物口服生物利用度篩選閾值均≥30%，化合物類藥性篩選閾值均≥0.18，以此得到符合條件的候選化合物。

1.2 紅花靶點預測 基于TCMSP數據庫結果，通過蛋白質數據庫（http：//www．uniprot．org/）獲得與化合物相對應的化學結構式，利用Swiss靶點預測數據庫（http：//swisstargetprediction.ch/）找到該化合物的預測靶點。

1.3 挖掘已知的NAFLD相關靶點 從目前可用的DisGeNET數據庫（http：//www.disgenet.org/2019版v6.0）和 OMIM 數據庫（https：//omim.org/）中，以“非酒精性脂肪肝”為關鍵詞，獲取NAFLD的已知靶點。

1.4 GO與通路富集分析 GO分析包括：生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）。KEGG通路富集分析是描述候選靶點特征的常用方法，本研究以P＜0.05作為假定值，利用數據庫對GO和KEGG信號通路分析。

1.5 成分-靶點-信號通路網絡構建 將紅花的有效活性成分與其治療NAFLD的潛在作用靶標關系及以P＜0.05的KEGG通路中前10位信號通路導入Cytoscape軟件中，構建出成分-靶點-信號通路網絡。

2 結果

2.1 紅花的活性化合物 通過TCMSP數據庫中獲取紅花中OB≥30%，DL≥0.18的化合物共18個。見表1。

表1 紅花的主要活性成分Tab.1 Main active components of Carthamus tinctorius

2.2 紅花與NAFLD交集靶點 根據篩選出的紅花預測靶點及已知NAFLD靶點，利用omicshare軟件畫出維恩圖，分析出交集靶點38個。見圖1。

2.3 蛋白交互關系網絡構建 利用STRING軟件構建了紅花治療NAFLD交互靶點間的蛋白關系網絡。網絡包含38個蛋白質節點，140條相互作用關系（連線）。見圖2。

圖1 紅花和NAFLD交互的38個常見靶點Fig.1 The 38 common targets for interaction between Carthamus tinctorius and nonalcoholic fatty liver disease

圖2 基于STRING的藥物-疾病靶標相互作用圖Fig.2 Drug-disease target interaction map based on STRING treatment of nonalcoholic fatty liver disease

2.4 GO富集結果分析 利用DAVID數據庫，將交互靶點的GO生物過程富集分析結果按照P由低到高排序，選擇排名前10的數據結果，得到生物過程結果如圖3A所示：分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、類固醇激素介導的信號通路、蛋白質磷酸化的正調控、一氧化氮生物合成過程的正向調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的負調控、調控細胞增殖、蛋白質磷酸化、膽固醇儲存負調控、細胞內受體信號通路。細胞成分的分析結果如圖3B所示，靶點主要涉及核、細胞質、質膜、受體和胞漿等。分子功能如圖3C所示，靶點主要涉及類固醇激素受體活性、藥物結合、酶結合、鋅離子結合、蛋白質結合、鐵離子結合、受體結合等。

圖3 對交互的基因進行GO分析Fig.3 GO analysis of interacting genes

2.5 紅花成分-靶點-信號通路網絡 該網絡共包括節點61個，邊134條。不同節點有不同的意義，其中菱形節點代表活性成分，正方形節點代表作用交集靶標，圓形代表信號通路，而邊則代表成分、靶標及信號通路的關系。不同靶標可對應相同的活性成分及信號通路，同一靶標也可與不同的活性成分及信號通路相對應，可見紅花治療NAFLD具有多成分、多靶點、多信號通路的特點。見圖4。

2.6 KEGG通路富集分析 將基因名稱導入DAVID數據庫，構建KEGG通路富集分析，以P＜0.05判斷具有顯著性進行篩選，共獲得33條富集通路，其中前10條KEGG通路分別為胰島素抵抗、PPAR信號通路、脂肪細胞因子信號通路、泌乳素信號通路、丙型肝炎、NAFLD、甲型流感、弓形蟲病、血清素的神經突觸、AMPK信號通路。見圖5。表明紅花的有效成分可能通過作用以上通路來治療NAFLD。根據以上分析，基于P值，選擇胰島素抵抗通路進一步了解紅花治療NAFLD的可能性。概念圖包含了胰島素抵抗通路中紅花的靶點和NAFLD靶點，基于這些數據，假設紅花通過調節胰島素抵抗通路治療NAFLD。概念圖見圖6。

圖4 紅花成分-靶點-信號通路網絡Fig.4 Carthamus tinctorius constituents-target-signal pathway network

圖5 活性靶點KEGG代謝通路氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of active target KEGG metabolic pathway

3 討論

中醫藥治療NAFLD的優勢已逐漸顯現，單味藥或諸藥合用都能調節肝臟脂質代謝，促進吸收和排泄，且可避免長期服用西藥帶來的不良反應。紅花具有明顯的降脂、抗氧化的作用，且能有效治療高脂血癥。

研究采用網絡藥理學方法，通過TCMSP數據庫共發現紅花化學成分189個，進一步篩選獲得主要活性成分18個，為紅花的研究提供了更多可能性。

圖6 紅花在胰島素抵抗通路中的KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of Carthamus tinctorius in insulin resistance pathway

通過構建靶點維恩圖，共獲得紅花治療酒精性脂肪肝相關靶點38個。分析交集靶點KEGG通路富集得到P＜0.05通路共33條，其中胰島素抵抗通路P值最小，富集靶點最多，分別為Akt，PPARA，TNF-α，GSK3B，PTP1B，INSR，CPT1A，LXR-α，提示紅花最有可能通過調節胰島素抵抗通路治療NAFLD。其中，Akt磷酸化減少，可以降低下游葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）表達，抑制葡萄糖的跨膜轉運，增加胰島素抵抗[7]。PPARA能有效誘導脂肪酸攝取、細胞內脂肪酸活化與結合、脂肪酸延伸和去飽和、三酰甘油（TG）和脂滴的形成與分解等多種脂質代謝途徑的基因表達[8]。TNF-α是胰島素抵抗調節過程中的重要因子，加快脂肪細胞分解，釋放大量游離脂肪酸（FFA）的同時抑制脂質轉運，導致肝臟脂質積累，從而誘發NAFLD。TNF-α促進釋放的FFA可以介導胰島素抵抗，反之胰島素抵抗與NAFLD的發生發展會導致FFA的升高，而FFA又可促使TNF-α升高，從而加重胰島素抵抗和NAFLD[9]。GSK3B是P13K/AKT通路的一個主要基質，胰島素刺激的AKT磷酸化GSK3B絲氨酸，從而使GSK3B失活，而GSK3B活性降低導致糖原合成酶磷酸化水平降低，從而導致糖原合成酶活性升高，糖原合成增加[10]。PTP1B在胰島素抵抗（IR）發生時表達顯著升高，通過作用于胰島素受體及其底物，減弱或終止胰島素信號傳導，產生IR[11]。CPT1A對脂肪細胞中的游離脂肪酸誘導的IR起保護作用，且可以抑制JNK因子從而阻斷游離脂肪酸引起的IR效應及炎癥反應。同時CPT1A表達增加可顯著降低TG的含量[12-13]。LXR-α可以激活脂肪細胞生成大量超過體內代謝能力的脂肪酸，導致脂肪堆積于肝臟引起肝細胞脂肪變性[14]。

西醫學研究認為IR、氧化應激及脂質過氧化可能是NAFLD發病過程中的重要環節?！岸未驌簟睂W說認為IR是引起肝細胞脂質積累并誘導機體對內源性損害因子敏感性增加從而導致NAFLD的第一次打擊[15]。因此IR是NAFLD的主要致病機制，是脂肪變性向脂肪性肝炎、肝硬化發展的觸發因素并貫穿該病全過程[16]。它減弱胰島素對脂肪代謝的調節，脂肪組織分解加強，促進游離脂肪酸在肝細胞內的沉積，導致肝細胞線粒體氧化超載，加重脂肪變性[17]。此外，增多的游離脂肪酸通過抑制胰島素信號傳導，減少胰島素清除，從而加重IR[18]。基于紅花對IR通路的調節作用及IR通路在NAFLD發病機制中的重要作用，提示了紅花治療NAFLD的可能性。

4 結論

研究通過網絡藥理學研究策略對紅花進行化學成分數據庫構建、靶點預測，為紅花的進一步研究提供了更多可能性。構建了紅花成分-靶點-信號通路圖，展示了紅花治療NAFLD具有多成分、多靶點、多信號通路的特點。分析了GO生物過程和KEGG通路富集，提示紅花治療NAFLD的作用可能與胰島素抵抗相關。對全面、深入探索紅花治療NAFLD的可能性具有重要的參考意義。研究僅是借用網絡藥理學的方法對紅花治療NAFLD進行了數據庫的分析研究，其研究結果仍需要進一步的實驗驗證。