電針干預豚鼠膜迷路積水的參數優選及其對耳蝸AQP2表達的影響

史瑩鶯 朱 敏 葉恬恬 楊俊文 江魯紅 蔣麗元

1.杭州市丁橋醫院 杭州 310022 2.杭州市中醫院 3.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院4.新疆維吾爾族自治區阿克蘇市人民醫院

梅尼埃病 （Meniere’s disease，MD）以發作性眩暈、聽力下降、耳鳴、耳悶脹感為典型臨床表現，是耳源性眩暈最常見的原因[1]。研究已經證實，MD的病理基礎是內耳膜迷路積水[2]。膜迷路積水的改善是緩解MD臨床癥狀的關鍵。臨床實踐表明，用電針治療MD具有較好療效，能改善前庭及內耳功能，緩解眩暈、耳鳴癥狀[3]。筆者在前期研究中經動物實驗證實，電針能顯著減輕耳源性眩暈豚鼠膜迷路積水，并且改善耳蝸聽功能[4]，與電針治療MD的臨床效果一致。

電針刺激頻率是影響電針療效的重要參數之一。目前關于電針治療MD刺激參數的研究較少，電針頻率的選擇尚缺乏統一標準。文獻報道，電針在鎮痛方面具有頻率依賴性[5]。研究已經證實電針可減輕膜迷路積水，但關于電針對膜迷路積水的調節作用是否也存在頻率選擇性的問題，至今尚未見于報道，而且電針減輕膜迷路積水的機制目前也不明確。本研究在血管加壓素誘導的膜迷路積水模型上，以聽性腦干反射（auditory brainstem response，ABR）反應閾值、耳蝸病理形態學為主要指標，觀察不同頻率電針刺激“百會”“聽宮”穴對豚鼠膜迷路積水的改善作用，篩選出最佳電針頻率參數，并通過檢測耳蝸水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）的表達變化，初步探討電針治療MD的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 清潔級健康雄性白色紅目豚鼠48只，體質量350～400g，耳廓Preyer反射靈敏，無眼震、無前庭功能異常表現，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供并飼養 [實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。實驗中對動物的所有處置均符合2006年國家科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中相關規定。將豚鼠以完全隨機法分為空白組、模型組、假電針組、2Hz電針組、15Hz電針組和100Hz電針組，每組8只。

1.2試劑與儀器 醋酸去氨加壓素購于海南中和制藥股份有限公司（批號：20170701）；AQP2多克隆抗體購于Santa Cruz公司（批號：Y-B1-07C17B）；DAB顯色試劑盒購于武漢谷歌生物科技有限公司 （批號：20180419）。華佗牌無菌針灸針購于蘇州醫療用品有限公司（規格：0.30mm×13mm）；HANS-100A型韓式鎮痛電針儀為南京醫療儀器廠產品。

1.3豚鼠膜迷路積水模型的建立與評價 除了空白組，其余各組參照文獻[6]采用腹腔注射醋酸去氨加壓素的方法建立膜迷路積水模型，先按4μg/（kg·d）劑量連續給藥7d，第8天將注射劑量加大為6μg/（kg·d），連續3d，共給藥10d。第11天起開始實施干預措施。豚鼠膜迷路積水模型的評價以耳蝸病理切片HE染色觀察結果為標準[7]。

1.4干預方法 空白組常規飼養，不予治療，10d后觀察各項指標。模型組造模完成后每日與各治療組動物采取相同固定方法及時間，不予其它治療，10d后觀察各項指標。各電針組造模后開始行電針治療，以一次性不銹鋼毫針于“百會”穴向前平刺2mm，左側“聽宮”穴直刺3mm，接HANS-100A型韓式鎮痛電針儀，輸出電流1mA，留針20min，1次∕d，連續治療10d。2Hz電針組、15Hz電針組、100Hz電針組刺激頻率分別為2、15、100Hz。穴位選擇參照《實驗針灸學》[8]，于動物顱頂骨正中處選取“百會”穴，于側面部耳屏正前方凹陷處選取“聽宮”穴。假電針組予針刺“百會”穴和左側“聽宮”穴，但不通電，其余處理同電針組。各組每日于相同時間點進行干預，取材當日不行干預措施。

1.5檢測指標

1.5.1ABR反應閾值檢測 干預結束次日，以10%水合氯醛按300mg/kg的劑量腹腔注射麻醉豚鼠，采用聽覺腦干誘發電位儀對各組豚鼠進行ABR反應閾值檢測，評估實驗側耳聽力水平。

1.5.2組織學指標 各組豚鼠麻醉狀態下快速開胸，充分暴露心臟，以4%多聚甲醛（pH=7.2）灌注，打開左側聽泡，分離顳骨，以4%多聚甲醛固定液固定過夜后，置于10%乙二胺四乙酸（pH=7.4）中，室溫下脫鈣約3周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。沿耳蝸蝸軸中央平面行4.5μm切片，再分別進行HE染色和免疫組化檢測。

1.5.2.1HE染色 切片常規脫蠟入水、烤片、梯度乙醇脫水，行HE染色、封片后，光鏡下觀察耳蝸形態，運用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統分別測量耳蝸中軸左右兩側第二轉蝸管橫截面積及前庭階橫截面積，并計算出比值（R值），R值=蝸管橫截面積/（蝸管橫截面積+前庭階橫截面積），耳蝸中軸兩側取平均值。

1.5.2.2免疫組化DAB染色 切片經脫蠟、水化、抗原修復后滴加一抗，洗滌后再加入二步法免疫組化試劑，行DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明后封片。光鏡下觀察AQP2表達情況，運用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統對結果進行分析，檢測耳蝸中軸左右兩側第二轉外側壁AQP2的表達，對AQP2積分光密度（integrate optical density，IOD）值進行測量，兩側取平均值。

1.6統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組豚鼠ABR反應閾值比較 各組豚鼠ABR反應閾值比較，差異無統計學意義（F=0.646，P＞0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠ABR反應閾值比較（±s，dB nHL）Tab.1 Comparison of ABR threshold in each group(±s，dB nHL)

表1 各組豚鼠ABR反應閾值比較（±s，dB nHL）Tab.1 Comparison of ABR threshold in each group(±s，dB nHL)

組別 豚鼠耳數（只） ABR反應閾值空白組 8 8.75±3.54模型組 8 10.63±4.17假電針組 8 12.50±2.67 2Hz電針組 8 9.38±6.78 15Hz電針組 8 8.75±5.82 100Hz電針組 8 9.38±6.23

2.2各組豚鼠耳蝸R值及形態比較 各組R值比較差異具有統計學意義（F=6.770，P＜0.01）。與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸R值增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組豚鼠耳蝸R值均降低（P＜0.01，P＜0.05）；與假電針組比較，100Hz電針組R值降低，差異有統計學意義（P＜0.01），2Hz電針組、15Hz電針組R值均較假電針組降低，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。各電針治療組組間比較，100Hz電針組R值低于2Hz電針組、15Hz電針組，差異有統計學意義 （均P＜0.05）；而2Hz電針組、15Hz電針組比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。見表2。

空白組均未出現膜迷路積水，前庭階、鼓階、蝸管結構無異常；模型組出現膜迷路積水，表現為前庭膜向前庭階方向不同程度的隆起擴張；各電針組前庭膜隆起程度均較模型組不同程度減輕；100Hz電針組前庭膜隆起程度輕于2Hz電針組和15Hz電針組，2Hz電針組、15Hz電針組前庭膜隆起程度無明顯差異。見圖1。

表2 各組豚鼠耳蝸R值比較（±s）Tab.2 Comparison of R values of the cochlea in each group(±s)

表2 各組豚鼠耳蝸R值比較（±s）Tab.2 Comparison of R values of the cochlea in each group(±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與假電針組比較，##P＜0.01；與 2Hz電針組比較，▼P＜0.05；與 15Hz電針組比較，ΔP＜0.05Note：Compared with blank group，**P＜0.01;compared with model group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;compared with sham EA group，##P＜0.01;compared with 2Hz EA group，▼P＜0.05;compared with 15Hz EA group，ΔP＜0.05

組別 豚鼠耳數（只） R值空白組 8 0.29±0.04模型組 8 0.49±0.06**假電針組 8 0.42±0.06▲2Hz電針組 8 0.40±0.10▲15Hz電針組 8 0.39±0.07▲▲100Hz電針組 8 0.32±0.06▲▲##▼Δ

2.3各組豚鼠耳蝸AQP2表達比較 各組AQP2 IOD值比較差異具有統計學意義 （F=5.239，P＜0.05）。與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸AQP2 IOD值增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組豚鼠耳蝸AQP2 IOD值均降低（P＜0.01，P＜0.05）；各治療組間比較，100Hz電針組AQP2 IOD值低于假電針組、2Hz電針組和15Hz電針組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖2。

3 討論

圖1 各組豚鼠耳蝸形態變化（HE染色，50×）Fig.1 Morphologic changes of the cochlea in each group(HE staining，50×)

表3 各組豚鼠耳蝸AQP2表達比較（±s）Tab.3 Comparison of AQP2 expression of the cochlea in each group(±s)

表3 各組豚鼠耳蝸AQP2表達比較（±s）Tab.3 Comparison of AQP2 expression of the cochlea in each group(±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01Note：Compared with blank group，**P＜0.01;compared with model group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 豚鼠耳數（只） IOD值空白組 8 6.70±1.23模型組 8 13.50±4.69**假電針組 8 7.19±1.92▲▲2Hz電針組 8 8.11±2.92▲▲15Hz電針組 8 9.54±4.74▲100Hz電針組 8 6.64±2.29▲▲

圖2 各組豚鼠耳蝸組織AQP2表達情況（DAB染色，100×）Fig.2 AQP2 expression of the cochlea in each group（DAB staining，100×）

中醫學并無“MD”病名，現多將MD引起的眩暈歸入“耳源性眩暈”。本虛標實為MD眩暈的基本病機，因此臨床對該病的治療多以補益為主?！鹅`樞·海論》有“髓海不足，則腦轉耳鳴”的記載，故臨床治療眩暈首選與腦髓有關的穴位。百會歸屬督脈，別名“三陽五會”，為手足三陽、督脈之會，具有補益腦髓、平肝息風、開竅止眩的功效，為治眩暈要穴。MD病位在耳，聽宮為手太陽小腸經穴，位于耳廓前，手太陽小腸經“卻入耳中”；聽宮又為手足少陽、手太陽之交會穴，內通心、腦及肝膽之氣，針刺聽宮可疏利肝膽之氣，宣通耳竅，多用于內耳疾病的治療。臨床上常以百會配伍聽宮，針灸治療內耳眩暈癥[9]。本研究結果顯示，針刺“百會”“聽宮”穴能顯著減輕豚鼠膜迷路積水程度，與課題組前期研究結果相符[4，10]。

膜迷路積水導致的聽力變化多與前庭膜破裂后內外淋巴液混合引發的耳蝸電生理改變有關。耳蝸電位是實現聽力功能的基礎。膜迷路積水時由于內淋巴液容量急劇增加，引起前庭膜過度膨脹直至破裂，高K+、低Na+的內淋巴液與高Na+、低K+的外淋巴液混合，內耳內環境紊亂，引起耳蝸電位下降，電活動受抑制，導致聽力下降。同時，外淋巴液K+濃度迅速升高，使毛細胞發生持續去極化，電壓依賴性鈣通道持續開放，內淋巴液及毛細胞發生鈣超載，同樣導致耳蝸電位下降，內耳聽功能受損，最終出現聽力下降[11]。本研究中HE染色病理切片觀察證實，通過血管加壓素腹腔注射誘導的膜迷路積水動物模型并無前庭膜的破裂，可能是ABR反應閾值未發生變化的原因之一。長時間血管加壓素處理后的膜迷路積水動物模型的ABR反應閾值變化情況，尚未見于文獻報道，仍有待進一步系統深入研究。

研究證實，與耳部疾病相關的大腦區域存在著神經元代謝異常的現象。李小圳等[12]研究發現，MD發作期與間歇期患者均存在靜息態雙側海馬區域功能連接差異，針刺穴位可激活有功能連接的多個腦區，從而發揮治療作用。動物實驗表明，電針刺激聽覺相關腧穴對經絡有特異性激發作用，使聽皮層局部神經細胞葡萄糖代謝水平增加，增強其生理活動[13]。電針的不同頻率是影響針刺效應的關鍵因素。本次研究中，采用不同頻率電針干預膜迷路積水豚鼠，結果顯示假電針、2、15、100Hz電針均有良好的治療作用。各治療組間比較，100Hz電針療效最佳，提示高頻電針對豚鼠膜迷路積水的改善更為顯著。近年來研究發現，高頻電針能夠治療神經系統、循環系統、內分泌系統等多系統疾病，因而在臨床上廣泛應用[14]。高頻電針治療急性心肌梗死并發心力衰竭，能夠升高血壓，降低患者死亡率[15]；還可以調節缺血再灌注大鼠血管活性物質含量[16]。研究還證實，高頻電針可以調節中樞和外周血清中神經遞質和神經肽類物質如γ-氨基丁酸、內源性膽囊收縮素、星形膠質細胞腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等的合成和分泌，從而起到鎮痛和神經系統保護作用[17-18]。而關于何種頻率的電針治療MD效果最佳，其具體機制如何，還鮮見于文獻報道。

目前認為，膜迷路積水發生與內耳水通道蛋白的表達及功能失調有關[19]?，F已發現的13個水通道蛋白亞型中，AQP2在內耳中的作用研究較為深入。AQP2是血管加壓素調節的靶蛋白，引起內耳AQP2表達改變的調節方式與腎臟集合管相同，血管加壓素與內耳血管加壓素受體2結合后，通過環磷酸腺苷介導的磷酸化作用引起AQP2表達增加及立體結構改變，使水通道開放增加，內淋巴液增多[20]。課題組前期研究結果表明，AQP2主要表達于耳蝸血管紋，注射血管加壓素可引起血管紋AQP2表達增加，針刺可下調血管紋處AQP2表達[21]。本研究結果表明，電針及假電針干預均可使模型組豚鼠耳蝸外側壁AQP2表達下調。電針刺激可能通過調控血管加壓素-AQP2系統，使耳蝸AQP2表達下調，水通道開放減少，抑制外淋巴液向內淋巴液流動，從而減輕膜迷路積水。

綜上所述，本研究發現不同頻率的電針針刺“百會”“聽宮”穴均能減輕豚鼠膜迷路積水，其中100Hz電針效果最佳。電針治療減輕膜迷路積水的機制可能與下調耳蝸AQP2的表達有關。