越鞠丸對功能性消化不良大鼠胃竇黏膜5-HT及胃腸激素水平的影響

葉 影 徐嘉淦 龍惠珍

1.溫州市中醫院 浙江，溫州 325000 2.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 3.浙江省中醫院

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是一種常見的功能性胃腸疾病，可分為餐后不適綜合征和（或）上腹痛綜合征，臨床上主要表現為餐后飽脹不適或餐后早飽，尤其以餐后早飽多見，或者出現中上腹痛、燒灼感，可伴有惡心嘔吐、噯氣、便秘等，常規檢查均不能發現解釋上述癥狀的器質性、系統性、代謝性疾病[1]。這些胃腸道癥狀可影響到患者日常進食量，嚴重者甚至影響日常活動，使患者生活質量下降。FD發病機制尚未完全明確，目前認為與胃腸激素水平失調、胃腸動力障礙、腦-腸軸功能紊亂以及精神心理因素有關。目前FD的西醫治療以多潘立酮、莫沙必利、依托必利、西甲硅油乳等胃腸動力藥為主，但長期服藥會導致諸多不良反應，如腹瀉、腹痛、口干、皮疹、過敏甚至嚴重心律失常、猝死等[2]。

中醫古籍中并未直接出現“消化不良”病名，依據癥狀，基本歸屬于“痞滿”“胃脘痛”等范疇。越鞠丸出自《丹溪心法》，現代研究發現越鞠丸具有抗抑郁、保護心臟、調節胃腸功能和調節代謝等作用，可應用于睡眠障礙、代謝綜合征、胃潰瘍、便秘、冠心病等疾病的治療[3]。本研究擬觀察越鞠丸對FD大鼠體重、進食、飲水量及胃排空率的影響，以及對胃竇黏膜5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量、血清血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）水平的影響，并探討其可能的作用機制，為臨床應用越鞠丸治療FD提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物與分組 SPF級雄性SD大鼠48只，體重（160±20）g，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心SPF環境中 [實驗動物使用許可證號：SYXK （浙）2016-0148]。飼養環境溫度20℃，光照12h，大鼠自由進食、飲水，適應性喂養3d。隨后將48只SD大鼠稱重，按照隨機數字表法分為對照組及實驗組。對照組大鼠8只不予特殊處理；實驗組40只，進一步隨機分為模型組、莫沙必利組、越鞠丸低、中、高劑量組，每組各8只。

1.2實驗藥物 越鞠丸藥物組成：神曲10g，蒼術10g，香附10g，梔子10g，川芎10g。以上藥物均由浙江省中醫院提供，并經過浙江中醫藥大學藥理實驗室加工制備，所有藥物加10倍水浸泡1h，大火煎煮1h，過濾除去藥渣；再加入6倍水煎煮1h，過濾除去藥渣，置于旋轉蒸發器中濃縮，使生藥濃度分別為0.45、0.9、1.8g·mL-1，置于 4℃冰箱備用。枸櫞酸莫沙必利片購于江蘇豪森藥業股份有限公司 （國藥準字：H19990315；規格：5mg/片），以蒸餾水溶解，配制成濃度0.15mg·mL-1的混懸液，置于4℃冰箱備用。

1.3主要試劑和儀器 5-HT免疫組化檢測試劑盒購于Sant Cruz公司（批號：S5545）；二抗購于福州市邁新生物技術開發公司 （批號：KIT-5006）；VIP酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購于上海信裕生物科技有限公司（批號：XY-VIP-Ra）；羧甲基纖維素鈉購于上海申光食用化學品有限公司（批號：FH45054119）；半固體營養糊由5g羧甲基纖維素鈉、8g奶粉、4g糖、4g淀粉、2mL 墨汁、125mL 蒸餾水配成[4]，濃度 1g·mL-1，使用前配置。酶標儀為芬蘭Labsystems Multiskan MS公司產品；倒置熒光顯微鏡及成像系統購于日本Nikon公司；MDF-382EAANSS型超低溫冰箱為日本SANYO公司產品。

1.4方法

1.4.1造模及給藥 實驗組大鼠按照郭氏夾尾法造模[5]。以長海綿鉗鉗夾大鼠尾部遠端1/3處，激怒大鼠，使之與其他大鼠撕打，從而使全籠大鼠都處于暴怒狀態，若尾部過度損傷，以0.5%碘伏適量消毒。單次不間斷夾尾刺激30min，每隔3h刺激1次，共4次/d，連續刺激7d。評估造模成功后開始給藥治療。對照組及模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃，2mL/次，1次/d；莫沙必利組予莫沙必利0.3mg/200g灌胃，2mL/次，1次/d；越鞠丸分為低、中、高劑量組，按照70kg體重成人與200mg體重大鼠的體表面積折算等效劑量比值0.018，計算得出低、中、高劑量分別為 4.5、9、18g·kg-1，分別以上述劑量灌胃，2mL/次，1次/d。各組大鼠均連續灌胃7d。

1.4.2觀察指標

1.4.2.1一般狀態 造模及治療時，每日觀察記錄實驗大鼠的精神狀態、活動量、皮毛色澤、大便形態等。

1.4.2.2大鼠體重、進食及飲水量測定 每日上午8：00各組予定量的固體顆粒飼料及蒸餾水，至次日早8：00測定剩余量，并每日記錄。每日上午9：00稱量各組大鼠的體重，并每日記錄。

1.4.3胃排空率測定 造模成功并末次給藥后禁食禁水24h，每只大鼠以2mL半固體營養糊灌胃，30min后麻醉處死動物，眼球取血4mL，開腹后分離全胃，賁門和幽門處以細線扎緊，濾紙擦干后稱重。沿胃大彎將胃剪開，以0.9%氯化鈉溶液充分清洗胃內容物，濾紙擦干后再次稱重。胃排空率（%）=1-（全胃重-胃凈重）/半固體營養糊重量×100%。

1.4.4大鼠胃竇黏膜組織形態觀察 將各組大鼠處死后，分離胃竇組織，迅速放入4%多聚甲醛中固定，依次脫水、透明、浸蠟、包埋和切片。每組隨機選取2張切片，常規脫水脫蠟，經蘇木精、伊紅染色后，在光學顯微鏡下放大100倍觀察胃竇黏膜組織形態。

1.4.5胃竇組織5-HT含量檢測 每組隨機選取2張石蠟切片，常規脫水脫蠟后，采用免疫組化法檢測各組大鼠胃竇組織的5-HT含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.6血清VIP水平檢測 各組大鼠麻醉后眼球取血4mL，4℃下3 000r/min離心10min，分離血清于-80℃超低溫冰箱保存，以ELISA法檢測血清VIP水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.5統計學分析 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示；本研究為多樣本的均數比較，樣本經偏度峰度檢驗呈正態分布，故主要采用單因素方差分析，滿足方差齊性時用LSD法，方差不齊時選用Dunnett’s T3檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1造模評估 夾尾法造模后，實驗組大鼠出現亂竄，前肢抬高、站立、撕打，并發出“呼呼”尖叫。夾尾第3天大鼠出現易怒、易驚、對外界聲音極其敏感；第5天大鼠打架反應遲緩、少動，大便偏稀；第7天大鼠出現懶動表現，鼠毛枯黃毛躁、脫落，身體消瘦，并有緊張焦慮，與所需FD模型表現符合，且各組造模大鼠未見明顯差異。與對照組比較，模型組大鼠進食及飲水量減少，體重減輕，胃排空率明顯下降，說明胃腸動力減退。HE染色結果顯示，各組大鼠胃竇黏膜未見活動性炎癥、糜爛、萎縮、不典型增生等病理改變，證明造模成功。

2.2各組大鼠體重、進食及飲水量比較 造模前，各組大鼠體重、進食及飲水量差異無統計學意義 （P＞0.05）。造模后，與對照組比較，模型組大鼠體重、進食及飲水量下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。給藥后，與模型組比較，莫沙必利組和越鞠丸各劑量組大鼠飲水量均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與莫沙必利組比較，越鞠丸各劑量組大鼠飲水量均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3各組大鼠胃排空率比較 與對照組比較，模型組大鼠胃排空率明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，莫沙必利組和越鞠丸中、高劑量組大鼠胃排空率增加，差異具有統計學意義 （P＜0.05）；與莫沙必利組比較，越鞠丸中、高劑量組大鼠胃排空率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各組大鼠體重、進食及飲水量比較（±s）Tab.1 Comparison of body weight,food and water consumption in each group(±s)

表1 各組大鼠體重、進食及飲水量比較（±s）Tab.1 Comparison of body weight,food and water consumption in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與莫沙必利組比較，ΔP＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with Mosapride group，ΔP＜0.05

體重（g） 進食量（g） 飲水量（mL）造模前 造模后 給藥后 造模前 造模后 給藥后 造模前 造模后 給藥后對照組 161.14±5.02 207.07±5.12 260.58±7.81 16.22±1.79 16.57±1.76 20.74±1.05 25.40±0.84 26.29±1.31 31.71±0.76模型組 163.71±7.62 174.7±10.09*233.33±13.35*15.86±1.13 12.10±1.95* 17.13±2.74*25.72±1.22 21.23±1.66* 27.89±0.73*莫沙必利組 157.80±6.05 173.74±6.52* 232.31±7.10* 16.68±1.76 12.77±2.06* 19.29±0.87 25.96±0.41 22.46±2.02* 30.34±1.52#越鞠丸低劑量組 160.54±5.36 173.78±9.34*229.87±13.94*16.43±0.58 12.73±2.13*20.08±1.48 26.10±0.64 20.90±1.68*32.97±1.48#Δ越鞠丸中劑量組 159.87±6.90 173.29±7.57*230.80±11.32* 16.52±1.48 12.03±1.90*20.07±1.60 26.02±1.07 21.64±0.71*34.44±2.08#Δ越鞠丸高劑量組 158.29±8.03 174.99±9.45*231.15±13.64*16.92±0.94 12.68±1.77*20.36±2.14 25.44±0.82 22.44±1.77*33.88±1.74#Δ組別

2.4各組大鼠胃竇組織5-HT含量比較 與對照組比較，模型組大鼠胃竇組織5-HT含量顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，莫沙必利組和越鞠丸中、高劑量組大鼠胃竇組織5-HT含量均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與莫沙必利組比較，越鞠丸低中劑量組5-HT含量較低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；高劑量組差異也無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、圖 1。

2.5各組大鼠血清VIP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清VIP水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05)；與模型組比較，莫沙必利組和越鞠丸中、高劑量組大鼠胃血清VIP水平均下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與莫沙必利組比較，越鞠丸中、高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 各組大鼠胃排空率比較（±s）Tab.2 Comparison of gastric emptying rate in each group（±s）

表2 各組大鼠胃排空率比較（±s）Tab.2 Comparison of gastric emptying rate in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05

胃排空率（%）對照組 8 49.25±12.80模型組 8 18.81±6.78*莫沙必利組 8 36.14±16.74#越鞠丸低劑量組 8 18.57±2.96越鞠丸中劑量組 8 43.21±20.52#越鞠丸高劑量組 8 48.50±9.82#組別n

表3 各組大鼠胃竇組織5-HT含量比較（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in gastric antrum in each group(±s)

表3 各組大鼠胃竇組織5-HT含量比較（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in gastric antrum in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05

5-HT含量對照組 8 26.011±1.531模型組 8 13.727±2.178*莫沙必利組 8 24.832±2.705#越鞠丸低劑量組 8 14.557±1.039越鞠丸中劑量組 8 19.176±1.703#越鞠丸高劑量組 8 24.513±4.144#組別n

圖1 各組大鼠胃竇組織5-HT的表達（400×）Fig.1 Expression of 5-HT in gastric antrum in each group(400×)

3 討論

前期臨床觀察中，筆者發現FD患者多有胃脘脹滿、痛或不痛、不欲食、噯氣、大便不暢、舌質偏紅或舌苔黃膩等特點，同時多存在情志抑郁或焦慮，屬于“郁證”型的功能減退性脾胃病。氣郁則中焦氣機阻滯，或夾食積、血瘀、痰積、濕阻，亦或化火。越鞠丸出自《丹溪心法·卷三》[6]，由香附、川芎、焦山梔、神曲、蒼術組成，對情志抑郁焦慮導致的FD患者療效頗佳。方中香附行氣解郁，為君藥；川芎治血郁，可助香附行氣為臣；梔子清熱瀉火，以治火郁；蒼術燥濕，以治濕郁；神曲消食，以治食郁，共為佐藥。香附為行氣解郁之要藥，藥理研究發現，香附不僅具有抗抑郁作用，同時也可促進胃腸動力[7]。川芎為行氣活血解郁之良藥，現代藥理研究證實，川芎能改善血管內皮功能，降低血流阻力，并能抗血小板聚集[8]。梔子泄熱除煩，具有抗炎鎮痛、保肝利膽、調節胃腸功能、保護神經、抗焦慮等功效[9]。蒼術行氣化濕解郁，現代藥理研究指出，蒼術具有抗胃潰瘍、調節胃腸運動以及提高消化吸收功能的作用[10]。神曲健胃消食，富含淀粉酶、蛋白酶等成分，其中酵母菌可調節腸道菌群，能夠促進胃腸動力[11]。

表4 各組大鼠血清VIP水平比較（±s）Tab.4 Comparison of serum VIP level in each group(±s)

表4 各組大鼠血清VIP水平比較（±s）Tab.4 Comparison of serum VIP level in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05

VIP（ng·L-1）對照組 8 110.75±9.03模型組 8 191.67±17.59*莫沙必利組 8 146.38±18.09#越鞠丸低劑量組 8 177.61±13.87越鞠丸中劑量組 8 153.87±12.91#越鞠丸高劑量組 8 149.12±10.64#組別n

從中醫理論來看，采取郭氏夾尾法復制的FD大鼠模型，較符合“怒傷肝，久則郁”的觀點。有研究顯示，FD的發病與胃腸激素水平紊亂相關[12]。5-HT、VIP均為胃腸激素的重要組成成分。5-HT是普遍存在于中樞神經系統和消化系統的神經遞質，作為腦-腸肽，與消化道功能活動關系密切。人體消化道黏膜中的5-HT含量約占人體總含量的90%，其余少部分存在于血小板和中樞神經系統中。胃腸道廣泛分布的5-HT及5-HT受體的異常改變可導致胃腸蠕動功能、感覺功能等的異常。近年來，國內外關于5-HT與FD發病相關性的研究取得了較大進展。朱良如等[13]認為，近端胃黏膜中5-HT合成的增多以及5-HT1A受體表達水平的增高，在一定程度上導致了胃機械感覺過敏。尋慶英等[14]采用自擬中藥通腑湯進行動物實驗，發現大鼠胃動力增加，而且其十二指腸及空腸黏膜中5-HT含量也明顯增加。另外，一些可調節人體內5-HT含量的促胃動力藥（如莫沙必利、西沙比利等）、抗抑郁藥和抗焦慮藥（如氟西汀等）能有效改善FD患者的癥狀，延緩復發。本研究結果顯示，模型組大鼠胃竇組織5-HT含量明顯降低，胃腸推動力下降，與上述研究一致，說明5-HT的含量降低與FD的發生發展有著密不可分的關系。

VIP是重要的抑制性肽類神經遞質之一，參與調節胃腸動力、松弛胃腸道平滑肌和括約肌、松弛膽囊等。VIP對腸道運動具有抑制作用，可使胃腸道動力不足，而VIP水平的下降可促進胃腸平滑肌的收縮，從而減少食物的停留時間[15]。有研究顯示，電針治療可降低FD模型大鼠胃腸道VIP水平，加速胃排空及小腸推進率[16]。本研究中模型組大鼠血清VIP水平升高，胃腸動力下降，而越鞠丸能下調VIP水平，改善食欲、促進胃腸動力，縮短食物在胃腸道的停留時間。

莫沙必利作為強效選擇性5-HT4受體激動劑，通過興奮胃腸道膽堿能中間神經元和肌間神經叢的5-HT4受體，促進乙酰膽堿釋放，從而促使胃腸道運動加強，是臨床常用的促胃動力藥物。本實驗中以莫沙必利作為陽性對照，結果表明越鞠丸能夠提高胃竇黏膜5-HT含量，增強胃腸動力，增加大鼠進食量及飲水量，其作用與莫沙必利組比較差異無統計學意義。

綜上所述，越鞠丸能夠改善FD大鼠的消化功能，增加胃排空率，其中高劑量組作用最強，其作用機制可能與增加胃竇組織5-HT含量，下調VIP水平有關。本研究結果僅證實越鞠丸能提高胃腸道5-HT含量，而是否影響中樞神經系統內5-HT含量尚不明確，有待進一步研究。