炎癥相關細胞因子及趨化因子在小鼠自身免疫性肝損傷不同時期的表達及作用

艾 國 雒真龍 張志成 王 鳴

細胞因子的合成和代謝，相互之間的拮抗或協同效益等在免疫和炎性反應中扮演重要角色，并與肝臟病理損傷密切相關[1，2]。促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子在肝臟中的過度表達可造成炎癥過程，是肝臟炎癥疾病的驅動力量之一，而具有募集免疫細胞及細胞因子作用的趨化因子亦可能參與其中。近年來的研究已經闡明一些重要的細胞因子在慢性肝臟疾病(如慢乙肝、脂肪肝、酒精肝、原發性膽汁性肝硬化等)中的作用，也有研究者關注了部分細胞因子在自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)發病中的作用，但是目前對自身免疫性肝炎的不同狀態下和肝臟內環境中促炎性、抗炎性以及趨化因子這3類細胞因子的水平變化和相互關系的研究尚不多見[3～6]。為此，筆者選取并檢測了促炎性細胞因子IL-6 和TNF-α，抗炎性細胞因子IL-10，以及趨化因子CXCL10在實驗性自身免疫性肝炎(experimental autoimmune hepatitis，EAH)小鼠發病期和緩解期中的表達水平差異和相互關系，探討自身免疫性肝損傷的機制，以期為自身免疫性肝炎的早期診斷和及時治療提供理論依據。

材料與方法

1.動物:雌性SPF級C57BL/6小鼠40只，4～6周齡，體質量20～22g，購買并飼養于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，供給無菌飲水及清潔飼料，適應環境溫度及濕度。

2.主要試劑:PCR擴增引物(武漢大風生物技術有限公司設計合成)；RT-PCR試劑盒(日本東洋紡公司)；IL-6、TNF-α、 IL-10和CXCL10 ELISA試劑盒(達科為生物技術有限公司)；弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)；組織蛋白抽提劑(武漢賽維爾生物有限公司)。

3.動物模型建立及分組:將小鼠隨機分為模型組和正常對照組，每組各20只；按照造模型方法建立EAH模型[7]。造模后第2周及6周，每組取6只小鼠，乙醚吸入麻醉后，眼眶動脈采取外周血，靜置離心后取血清，檢測轉氨酶ALT、AST水平；小鼠處死后，取肝組織一部分予以4%甲醛固定，行石蠟包埋切片和HE染色，然后光鏡下閱片觀察肝組織的病理改變情況；一部分快速凍存于液氮中以提取總RNA和組織蛋白。

4.real-time PCR檢測肝組織炎性相關細胞因子和趨化因子的mRNA表達水平：采用TRIzol試劑等提取肝組織總RNA，定量反轉錄合成cDNA，然后用SYBR GreenⅠ熒光染料技術在25μl PCR反應體系進行PCR擴增。引物設計：內參：GADPH：5′-CAGTGCCAGCCTCTGCTCAT-3′(上游引物)，5′-ATACTCAGCACCAGCACAT-3′(下游引物)；IL-6：5′-GACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATACAG-3′(上游引物)，5′-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCCAC-3′(下游引物)；TNF-α：5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′(上游引物)，5′-GCCATAGAACTGATGAGAGG-3′(下游引物)；IL-10：5′-AACATACTGCTAACCGACTC-3′(上游引物), 5′-ATGCTCCTTGATTTCTGG-3′(下游引物)；CXCL10：5′-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3′(上游引物)，5′-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3′(下游引物)。real-time PCR反應條件：95℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 20s，72℃ 40s，主循環40次，采用2-△△CT法，通過所獲循環閾值(Ct)計算目的基因相對表達水平。

5.ELISA法檢測肝組織炎性相關細胞因子和趨化因子蛋白表達水平:稱取50mg肝組織加入400μl含有PMSF的組織蛋白抽提液中，電動勻漿后，2000r/min離心10min，提取上層清液即組織蛋白液，用ELISA試劑盒依照說明書步驟檢測肝組織勻漿中IL-6、TNF-α、IL-10和CXCL10的含量，酶標儀450nm檢測待測樣本，繪制出標準曲線，得到線性回歸方程，然后將樣本的吸光度值代入回歸方程，得到濃度值。

結 果

1.小鼠肝臟病理學改變:EAH組小鼠在建模后2周即發病期，肝臟HE染色顯示較多淋巴細胞在血管周圍和匯管區等部位浸潤，肝細胞部分出現局灶性壞死，炎性反應較明顯(圖1B)；而在緩解恢復期(6周)，炎性細胞的浸潤以及肝細胞的壞死程度較2周減輕(圖1C)。正常小鼠肝臟HE染色則如圖1A所示。

2.小鼠血清轉氨酶水平改變：EAH小鼠的ALT和AST水平在2周時較正常對照組(0周)均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，兩者的升高與肝臟病理改變程度相一致。在6周時的ALT 水平較正常對照組略高，差異無統計學意義；AST 水平則仍較正常對照組偏高，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 小鼠肝臟病理改變(HE染色，×400)A.正常對照組；B.EAH組2周；C.EAH組6周

圖2 各組小鼠血清ALT、AST的生化檢測結果*P<0.05，**P<0.01

3.小鼠肝臟炎癥相關細胞因子及趨化因子mRNA水平變化:通過real-time PCR檢測觀察到， EAH小鼠肝臟組織IL-6(P=0.035)、TNF-α(P=0.047)、IL-10(P=0.032)和CXCL10(P=0.028)在2周時mRNA表達水平較正常對照組明顯增高，在6周時的IL-6(P=0.047)和IL-10(P=0.016)的mRNA表達水平仍稍高于正常對照組，差異有統計學意義；TNF-α(P=0.082)和CXCL10(P=0.061)的mRNA表達水平略高于正常對照組，差異無統計學意義。2周與6周之間比較，EAH小鼠肝組織IL-6 (P=0.080)、TNF-α (P=0.082)、IL-10(P=0.058)的mRNA表達水平下降但差異無統計學意義。CXCL10 mRNA水平下降(P=0.047)，差異有統計學意義(圖3)。

圖3 小鼠肝臟炎癥相關細胞因子及趨化因子mRNA水平變化*P<0.05

4.小鼠肝臟炎癥相關細胞因子及趨化因子蛋白水平變化：通過ELISA法檢測觀察到，EAH小鼠肝臟組織IL-6(P=0.004)、TNF-α(P=0.038)、IL-10(P=0.043)和CXCL10(P=0.035) 在2周時蛋白表達水平較正常對照組明顯增高，在6周時的IL-6(P=0.006)、TNF-α(P=0.015)和IL-10(P=0.045)的蛋白表達水平仍高于正常對照組，差異有統計學意義；CXCL10(P=0.560)的蛋白表達水平略高于正常對照組，差異無統計學意義。2周與6周之間比較，EAH小鼠肝組織IL-6 (P=0.015)和CXCL10 (P=0.040)的蛋白表達水平下降，差異有統計學意義；TNF-α(P=0.137)、IL-10(P=0.180) 的蛋白表達水平下降，但差異無統計學意義(圖4)。

圖4 小鼠肝臟炎癥相關細胞因子及趨化因子蛋白水平變化*P<0.05,**P<0.01

5.相關性分析：Pearson相關分析顯示，EAH小鼠肝組織勻漿中CXCL10與IL-6、TNF-α、IL-10均呈正相關(r分別為0.8214、0.8910、0.8504，P均<0.05)；IL-10與 IL-6、TNF-α均呈正相關(r分別為 0.9644、0.8897，P均<0.05)。

討 論

自身免疫性肝炎是異常的自身免疫反應介導的肝細胞損傷和肝實質炎性病變，目前在肝病方面關于相關細胞因子的研究結果尚存在一定差異，尤其在自身免疫性肝炎的細致變化仍具有一定研究空間。結合既往文獻，本研究選取部分細胞因子并就其在EAH中的表達變化進行了探索分析。

研究結果顯示，在EAH發病期，肝臟內的IL-6在mRNA和蛋白表達水平均明顯升高，同時伴隨血清轉氨酶升高和肝臟炎性細胞浸潤增加。IL-6作為一種重要的炎性細胞因子，在宿主防御、調控B細胞、活化自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、參與炎性反應進程中均發揮重要作用[8]。盡管其表達調控遵循轉錄機制，一旦轉錄后機制失調，持續產生的IL-6卻對慢性炎癥及自身免疫性疾病具有病理作用[9]。IL-6可通過gp130 激活JAK/STAT 信號通路介導炎性反應[10]。IL-6/STAT3信號通路可招募并活化中性粒細胞(PMN)，經過趨化、黏附，滲出血管壁浸潤至肝實質內的PMN活化，可引起肝細胞的損傷[11]。已有臨床研究表明，慢性肝臟疾病、肝硬化患者血清IL-6水平的持續升高，對肝臟組織造成不良后果[6]。本研究顯示，IL-6的表達在緩解期雖有下降仍高于正常水平，這也說明持續的IL-6表達可作用于整個自身免疫性炎癥發生、發展的過程。

與IL-6的表達變化類似，筆者發現促炎細胞因子TNF-α亦表現為發病期表達水平均升高，在緩解期隨著血清轉氨酶水平下降和肝內炎性細胞浸潤減少，TNF-α的表達水平雖較發病期有所下降，但基本仍然高于正常水平。TNF-α主要是由巨噬細胞和單核細胞分泌，可觸發TNF-α和IL-6本身的級聯反應。TNF-α在機體的炎性反應和免疫調控中具有較為重要的功能，即活化巨噬細胞、增加細胞毒性、抑制B細胞的激活及抗體的產生、調節HLAⅡ類分子和黏附分子的表達，以及促進遲發型超敏反應等。TNF-α的這些生物學效應能夠加重機體自身免疫反應，從而令自身免疫性疾病進展加速[12]。在關于Th17細胞及其細胞因子與AIH相關性的研究中發現，Th17細胞的數量及分泌的細胞因子如IL-6和TNF-α等增加與肝臟炎癥和纖維化嚴重程度有關[13]。這也與筆者在EAH模型中觀察到的結果基本相符。結合本研究觀察結果和相關文獻報道，筆者推測IL-6及TNF-α作用于整個自身免疫性炎癥發生、發展的過程，可作為炎性反應的敏感指標，亦是疾病進展的重要影響因素。

IL-10是具有抑制細胞免疫反應、促進體液免疫反應和抗炎功能的細胞因子，在細胞因子網絡調節中發揮重要作用[14]。IL-10可抑制單核細胞生成TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ等細胞因子，刺激單核細胞產生IL-1受體拮抗劑，發揮抗炎功能[15]。本研究顯示，EAH小鼠肝臟IL-10的表達水平從發病期至緩解期均高于正常，且伴隨IL-6及TNF-α變化而變化，相關性分析顯示IL-10與 IL-6、TNF-α均呈正相關，而并非負相關，推測IL-10表達水平的這種變化可能為機體維持免疫平衡的代償性改變。以上幾種促炎性細胞因子與抗炎性細胞因子的表達變化和關系如上所述，那么跟兩者密切相關的趨化因子的表達狀況又會是如何？

趨化因子家族在肝臟微環境中關于細胞之間的信號調節方面的研究已逐漸受到重視[16]。其中CXCL家族可在某些自身免疫性疾病中發揮明顯的促炎效應，如原發性膽汁性肝硬化患者外周血和肝組織中CXCL9和CXCL10表達水平顯著增加，且隨疾病進展而升高[17]。而在本研究中EAH小鼠肝臟內CXCL10表達水平表現為在發病期增高，緩解期則下降。趨化因子本身能夠與血管內皮細胞相結合，具有激活并趨化白細胞移動的作用[18]。趨化因子信號系統對于效應細胞和調節細胞的募集有關鍵作用，參與肝臟免疫性疾病的發生[19]。本研究中EAH小鼠肝臟內CXCL10表達水平與IL-6、TNF-α、IL-10均呈正相關，表明CXCL10在自身免疫性肝炎中可能既募集表達促炎性細胞因子又能募集表達抗炎性細胞因子的免疫細胞，參與肝臟炎癥活動，某種程度上可能具有雙向調節的作用。

綜上所述，促炎性細胞因子、抗炎性細胞因子及趨化因子等細胞因子形成錯綜復雜的細胞因子調節網絡，作用于肝臟并影響肝臟疾病發生、發展；理解這些細胞因子在疾病發生、發展過程中的變化和作用，對于闡釋AIH的肝損傷機制具有重要意義；針對細胞因子的分子靶向治療也為肝臟疾病提供了新的診療思路和干預手段。