annexin A2體外胚胎著床的功能阻滯研究

葉天民 彭鼎佳 高 晶 王 琨 霍 然 肖 佳 楊樹標

隨著現代社會的進步，不孕癥是整個社會面臨的一個問題。1978年英國誕生了首例試管嬰兒，標志著人類擁有了輔助生育技術以及后續不斷完善的各種相關技術，在很大程度上幫助了不少不孕癥患者，但醫學工作者也發現，移植的優質胚胎移植入母體子宮后仍然沒有得到成功妊娠。其中的主要問題還是在于胚胎著床尚無法在掌控之中。所以目前輔助生育技術的治療成功率仍然徘徊在30%左右[1]。胚胎著床是發生在母體內非常重要的生理過程，在哺乳動物的不同物種中，基本的過程及步驟都很相似。大體分為3步，即定位、黏著和侵入。定位是指胚胎在子宮內膜表面不穩定的黏著。此后，黏著步驟是指囊胚滋養細胞開始具有黏著能力并黏于子宮內膜表面。隨后，滋養細胞穿破子宮內膜的腔上皮細胞層，進入內膜的間質，即侵入過程[2]。這個過程需要胚胎和子宮之間非常精密而和諧的對話才能完成[3]。胚胎著床由諸多分子及其所在通路介導，其中包括了性激素、生長因子、細胞因子、黏著分子和脂質等[4]。但其中具體的機制如何，仍是一個不解之謎。

annexin A2 是annexin成員之一。 annexin是一組通過鈣離子依賴方式連接于磷脂陰離子上的蛋白質。目前在高等脊椎動物中發現至少有12種[5]。膜結合annexin A2是一個四聚體結構，包括兩個annexin A2分子和兩個P11 (S100 鈣結合蛋白A10) 分子。annexin A2是Src (Rous肉瘤基因) 激酶的底物，功能涉及細胞轉化、分化、分泌功能調節、泌乳素釋放和前列腺素形成[5～7]。研究發現，在人類子宮內膜中，annexin A2在內膜接受胚胎著床期高表達而在接受胚胎著床的前期為低表達[8～10]；這些結果說明了annexin A2在胚胎著床中有相關的功能作用。研究發現，鈣離子在胚胎著床中起著非常重要的作用。因為在孕第4天小鼠的宮腔內注入鈣通道阻滯劑會導致胚胎著床的失敗[11,12]。另外，鈣離子調節蛋白可以調節細胞內鈣的平衡，并且它在內膜接受胚胎著床期為高表達，而在接受胚胎著床的前期為低表達[13]。因為annexin A2就是鈣通道依賴而發生功能的，說明它和胚胎著床的關系和機制是這樣產生的。近年來，annexin A2在生殖領域的研究不斷深入。目前發現，annexin A2在胚胎著床中的作用是通過RhoA的激活和蛋白的調節而產生的[14]。一些體外實驗發現，在靈長類子宮內膜上皮細胞及Ishikawa細胞系中，白介素11可以上調annexin A2的表達[15]。白介素11也是胚胎著床過程中非常重要的一個因子。

筆者之前的一些小鼠子宮內膜表面蛋白的蛋白質組學研究也發現了annexin A2在內膜接受胚胎著床期和接受胚胎著床的前期的表達有明顯差異[16]。本研究通過筆者已有的小鼠體外胚胎著床模型對annexin A2在胚胎著床中的重要功能進行研究[17]。

材料與方法

1.動物模型：小鼠三維體外胚胎著床模型運用ICR小鼠囊胚與子宮內膜組織進行研究：本研究所有健康雌性及雄性ICR小鼠由香港大學實驗動物中心提供。所有實驗均得到香港大學實驗動物倫理學委員會批準。按照筆者已經建立的小鼠體外著床模型進行實驗研究，將孕第4天ICR小鼠囊胚與子宮內膜組織進行體外共培養。觀察各組胚胎黏著率的差異[17]。本實驗共設4組：第1組將ICR小鼠的內膜組織用1.0μg/ml的annexin A2抗體進行預培養1h(預處理)；第2組將ICR小鼠的內膜組織用0.1μg/ml的annexin A2抗體進行預培養1h；第3組將ICR小鼠的內膜組織用1.0μg/ml的對照IgG抗體進行預培養1h；第4組的小鼠子宮內膜組織未經任何抗體預處理。

2.免疫組化：小鼠子宮內膜組織經過固定、石蠟包埋之后，常規石蠟切片制片。切片組織厚度為5μm。切片經脫蠟后進行常規處理。組織切片用傳統免疫組化的抗原修復、過氧化氫處理，加一抗(1∶500)、二抗(1∶800)后用ABC+DAB法進行顯色。其中一抗為兔抗鼠annexin A2(購自英國Abcam公司)，二抗為羊抗兔IgG(購自美國Dako公司)。

3.統計學方法：采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行統計分析，兩組之間胚胎黏著率的比較，用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.通過三維體外胚胎著床模型來檢測annexin A2在胚胎著床中的作用：ICR小鼠內膜組織用annexin A2抗體及正常IgG抗體對照進行預培養，然后運用體外3D著床模型進行黏著率檢測。小鼠子宮內膜經濃度為1.0μg/ml及0.1μg/ml的annexin A2抗體預處理后小鼠囊胚在其上的黏著率分別為45.6%及53.6%；而抗體濃度為1.0μg/ml的正常IgG對照及未經抗體處理的空白對照組的黏著率分別為55.4%及59.0%。經過1.0%的annexin A2抗體預處理組與兩組對照組之間的黏著率比較差異無統計學意義(P=0.30，P=0.15)。

表1 經過與未經過LIF抗體抑制的內膜與胚胎在體外共培養模型中的黏著率

2.小鼠子宮內膜組織annexin A2的免疫組化染色：孕第1、4天ICR小鼠子宮內膜組織及孕4天小鼠內膜組織在與小鼠囊胚共培養之前用1.0μg/ml和0.1μg/ml annexin A2抗體預處理后行免疫組化染色。孕第4天小鼠子宮內膜組織的annexin A2表達明顯高于孕第1天小鼠子宮內膜組織；但是，經過annexin A2抗體預處理后，未見到annexin A2表達明顯降低(圖1)。

討 論

圖1 GFP小鼠與ICR小鼠子宮內膜組織共培養28h后組織學圖像(免疫組化染色，×400)A.孕第1天小鼠子宮內膜組織； B.孕第4天小鼠子宮內膜組織；C.經過0.1μg/ml annexin A2抗體預處理后的孕第4天小鼠子宮內膜組織；D.經過1.0μg/ml annexin A2抗體預處理后的孕第4天小鼠子宮內膜組織；LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.間質細胞

胚胎著床過程非常精密，難以全面解開，直到目前，已經有很多技術運用到了研究胚胎著床的研究中。比如在母體方面，對活檢內膜組織和宮腔沖洗液的基因組以及蛋白組學的研究[18～21]。在胚胎方面，研究著床前胚胎代謝產物時發現了一些可能與胚胎高著床能力相關的分子。但是，這些研究的缺陷在于，用一些靜態的方法去觀察一個動態的體內過程，或者說僅在某個單方面去探究母體子宮內膜或者胚胎。然而，如果建立一個人體體內的著床模型比較困難，首先存在技術和倫理學的問題。所以開發研究胚胎著床的體外模型是一個非常適合的手段及平臺。目前，大體有3種三維體外著床模型建立并已在著床研究中運用。這3類模型中，有一類模型是胚胎和子宮內膜組織共培養的三維體外著床模型，報道相對比較少，這一類模型的優勢在于運用原代內膜組織的培養，相比其他模型，它更加接近體內的環境和狀況。此類模型的首例報道是在1961年,之后1973～1993年也有少數類似的模型相繼報道，但總的來說，此類模型報道很少。筆者于香港大學婦產科系建立了一種新型的三維模型。筆者研究發現，在處理過的人類羊膜上培養內膜組織可以維持正常形態的子宮內膜達到72h。于是，筆者再將囊胚置于其上進行共培養，這是之前其他模型均沒有做到的。在此模型中，小鼠囊胚體外的黏附率可以達到50%以上；并且，筆者觀察到了在靠近胚胎黏附位置附近的子宮內膜組織出現了蛻膜化的改變[17]。之前同類模型尚無這樣的報道。

新型的著床模型建立以后，隨后的相關功能性實驗也同時開展。很多與胚胎著床相關的分子均用本模型得到了功能上的證實，如白血病抑制因子(LIF)[17,22]。在筆者實驗室另一項研究中，將小鼠孕第1天和第4天的子宮內膜表面蛋白質進行標記并純化，進行對比蛋白質組學的研究，在一系列差異表達蛋白質中，筆者發現annexin A2在孕第4天的表達和孕第1天明顯不同，差異在2倍以上[16]。這提示annexin A2可能和胚胎著床有著密切的關系。之前也有研究者發現在人類子宮內膜中，annexin A2在內膜接受胚胎著床期高表達而在接受胚胎著床的前期為低表達[8～10]。這些結果說明了annexin A2在胚胎著床中有相關的功能作用。所以筆者將小鼠孕第1天和第4天的子宮內膜組織進行免疫組化染色，發現在第4天的表達明顯高于第1天，這和之前的研究結果是相符合的。為了進行功能性研究及證實，筆者將子宮內膜組織用annexin A2抗體進行預處理，實驗步驟和筆者對LIF進行功能性研究是一樣的[17,22]。但是，胚胎黏著率并沒有因為annexin A2抗體預處理而顯著性降低。雖然從數值上看，運用1.0μg/ml annexin A2抗體預處理組的黏著率低于2個對照組，但差異均無統計學意義(表1)。這有可能和樣本數量還不夠大有關；隨后，筆者又將annexin A2抗體預處理過的小鼠子宮內膜組織進行免疫組化染色，結果發現annexin A2的表達并沒有明顯減少(圖1)。從免疫組化染色的圖片中還可以發現，annexin A2的表達主要集中于細胞膜表面，并且在上皮及間質細胞均有表達。annexin A2又是一種鈣離子通道依賴的蛋白質[5]。所以研究發現它是一種分泌性蛋白質。所以用抗體阻滯的方式未必能夠抑制它的功能，原因有可能是：①抗體的濃度及量還不夠大；②內膜組織不斷分泌annexin A2來維持它的功能；③體外實驗是敞開式環境，無法使抗體的阻滯作用集中發揮。

綜上所述，annexin A2在第4天的子宮內膜組織表達明顯高于第1天的子宮內膜組織。運用抗體進行阻滯實驗時并不能顯著降低體外胚胎在子宮內膜組織的黏著率。隨后進行相關小鼠體內研究或者將annexin A2整體表達量進行降調可能會獲得陽性的結果。