腺苷脫氨酶在兒童EB病毒相關噬血細胞綜合征中的意義

高 慧 張俊峰 劉娟娟 沈紅強

噬血細胞綜合征又稱噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(hemophagocyticlymphohistiocytosis，HLH)，是免疫系統過度活化的炎性反應綜合征，是兒科危重難治性疾病，臨床上以持續高熱和巨噬細胞活化產生噬血現象為主要特征[1]。HLH分為原發性和繼發性兩種類型，原發性HLH由遺傳性免疫缺陷導致，而繼發性HLH常由感染、腫瘤、自身免疫性疾病誘發。無論原發性還是繼發性，感染都是最常見的觸發因素，而EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染最多見。EBV相關噬血細胞綜合征可在慢性活動性EB病毒感染基礎上發生HLH，因此尋找對EBV-HLH早期診斷與鑒別診斷及預后評估有價值的臨床指標具有重要意義。

腺苷脫氨酶(ADA)是一種與機體細胞免疫活性有重要相關性的核酸代謝酶，ADA在淋巴細胞尤其是T淋巴細胞分化成熟中具有重要作用[2]。大量研究表明，血清或體液ADA水平在結核性腦膜炎、系統性紅斑狼瘡患者及2型糖尿病等的鑒別診斷和免疫功能研究中具有重要的臨床意義[3～5]。

本研究通過檢測EBV-HLH患兒血清ADA水平，分析其在鑒別診斷EBV-HLH與慢性活動性EBV感染、評估臨床療效和預后判斷中的價值。

對象與方法

1.研究對象：選取2015年1月～2017年12月在浙江大學醫學院附屬兒童醫院初次入院確診為EBV-HLH的72例患兒為研究對象，同期80例慢性活動性EBV感染患兒為對照組，健康體檢兒童為健康對照組，年齡1～18歲。EBV-HLH診斷標準[6]：有明確EBV感染證據并符合HLH-2004指南的診斷標準。定義外周血漿中EBV-DNA拷貝數>500拷貝數/毫升即診斷為EBV感染; HLH的診斷參照國際組織細胞學會制定的HLH-2004方案，滿足符合以下8項中的5項：①發熱；②脾腫大；③外周血兩系或三系減少血紅蛋白<90g/L、 血小板計數<100×109/L、中性粒細胞絕對值<1.0×109/L；④高甘油三酯血癥或低纖維蛋白原血癥(甘油三酯≥3.0mmol/L, 纖維蛋白原<1.5g/L)；⑤血清鐵蛋白升高(≥500μg/L);⑥可溶性CD25升高(≥2400U/ml)；⑦NK細胞活性減低或缺失；⑧骨髓、脾臟、腦脊液或淋巴結活檢發現組織細胞增生并伴噬血細胞現象, 且無惡性疾病證據。CAEBV感染診斷參照2005年Okano 等[7]修訂的診斷標準。

2.研究方法：所有研究對象為當日空腹靜脈血3ml，3000r/min，離心10min，取血清后于當天檢測。貝克曼AU5800全自動生化分析儀及配套試劑，采用酶法測定ADA、ALT及AST。檢測前當日室內質量控制均在控。根據ALT、AST水平將EBV-HLH患者分為肝功能正常組和肝功能異常者，比較兩組間ADA水平。并比較分析肝功能正常的EBV-HLH患者和健康對照組ADA水平差異。根據患者臨床治療轉歸，將72例EBV-HLH患者分為生存組與死亡組，對比分析兩組間實驗室特征。采用熒光定量PCR分析儀檢測血漿EBV DNA拷貝數，并對ADA水平與EBV DNA拷貝數進行相關性分析。

結 果

1.臨床資料：EBV-HLH組和CAEBV組患兒一般臨床資料詳見表1。72例EBV-HLH患兒年齡為1歲1個月～14歲3個月，中位年齡為2.8歲，其中男性38例，女性34例; CAEBV組患兒80例，其中男性38例，女性42例,患兒年齡6個月～12歲7個月，中位年齡2.7歲。同期健康體檢者為對照組50例，其中，男性26例，女性24例，中位年齡3.2歲。

表1 EBV-HLH組和CAEBV組患兒一般情況和臨床實驗室指標分析

2.EBV-HLH組、CAEBV組及健康對照組患兒ADA水平比較: EBV-HLH組ADA水平為102.4±64.9U/L, CAEBV組ADA水平為42.8±22.1U/L，而健康對照組的 ADA 水平為13.3±3.2U/L，通過非參數檢驗得出3組間比較差異有統計學意義(P=0.000), EBV-HLH組ADA水平明顯高于CAEBV組(Z=4.709，P=0.000)，CAEBV組顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(Z=5.008，P=0.000),詳見圖1。

圖1 EBV-HLH組、CAEBV組和健康對照組ADA水平比較

3.ROC分析: 根據EBV-HLH組及CAEBV組血清ADA水平繪制ROC曲線，以CAEBV組為對照，分析得出ADA診斷EBV-HLH的ROC曲線下面積為0.801，95%CI:0.827～0.940，取其閾值為57.5U/L時，敏感度為74.7%，特異性為89.1%，詳見圖2。

4.肝臟功能對ADA水平的影響: 根據ALT、AST水平(表2)，將EBV-HLH組分為肝功能正常組和肝功能異常組，前者24例，后者48例。肝功能正常的EBV-HLH患兒ADA水平為63.57±39.95U/L，肝功能異常的EBV-HLH患兒中ADA 水平為120.65±66.64U/L，其中肝功能正常的EBV-HLH患者 ADA 水平與健康對照組比較，差異有統計學意義(Z=6.121，P=0.000)。并且肝功能正常的EBV-HLH患者 ADA 水平與肝功能異常的患者比較，差異有統計學意義(Z=-3.583，P=0.000)。

圖2 EBV-HLH患者ADA分布的ROC曲線

表2 EBV-HLH患者肝功能狀況分析

5.EB病毒DNA拷貝數與ADA的相關性分析: 72例EBV-HLH患兒EB病毒拷貝數為4.39±1.18logU/ml,Pearson相關分析得出，EBV拷貝數與ADA相關系數r=0.608，呈正相關，差異有統計學意義(P=0.000)，詳見圖3。

6.生存組和死亡組實驗室特征比較：死亡組血清ADA水平顯著高于存活組(P=0.002)，血小板計數水平明顯降低(P=0.048)，詳見表3。

圖3 ADA水平與EBV-DNA載量的相關性

表3 生存組和死亡組EBV-HLH患兒實驗室特征比較

討 論

ADA是機體細胞免疫系統中一種重要核酸代謝酶,主要存在于粒細胞、紅細胞和淋巴細胞中。隨著淋巴細胞分化程度的增高,其酶活力逐漸降低。近年來血清及體液中ADA活性測定已在多種疾病的診斷、鑒別診斷以及免疫障礙機制研究中越來越受到重視[8]。ADA在T淋巴細胞中的活性要高于B淋巴細胞，且可作為非特異性分子，在T淋巴細胞增殖、分化和成熟過程中發揮重要作用[9]。

EBV相關噬血細胞綜合征可在慢性活動性EB病毒感染基礎上發生暴發性HLH，也可在傳染性單核細胞增多癥過程中反復發作導致患者死亡。因此尋找對EBV-HLH早期診斷與鑒別診斷及預后評估有價值的臨床指標具有重要的意義。本研究旨在探討血清ADA水平在EBV相關噬血細胞綜合征中的意義。本研究結果顯示，EBV-HLH患者ADA水平明顯高于EBV感染組，EBV感染組患兒顯著高于健康體檢者。Chen等[10]研究發現血清ADA水平在淋巴瘤相關噬血細胞綜合征中顯著升高。以上結果提示，ADA 的檢測可為臨床鑒別診斷EBV-HLH提供有效的參考。本研究進一步分析ADA水平與EB病毒拷貝數的相關性，得出相關系數為0.608，呈正相關。研究表明，血漿EB病毒拷貝數可以作為生物學標志物評價EBV感染相關性疾病的嚴重程度和預后[11]。進一步比較EBV-HLH患者生存組與死亡組實驗室特征，死亡組ADA水平顯著高于生存組，同時結果表明，血清ADA活性有助于判斷EBV-HLH患者預后情況。

根據EBV-HLH患者和EBV感染患者血清ADA水平繪制ROC曲線。結果顯示 ADA的曲線下面積為0.893，95%CI:0.827～0.940。當閾值為57.5U/L時，敏感度為74.7%，特異性為89.1%。說明診斷準確性較高，具有較高的診斷價值。文獻證實，ROC曲線下面積>0.9表明篩查價值很高,>0.7表明篩查價值中等[12]。結果提示，血清ADA水平在診斷EBV-HLH特別是預警CAEBV進展為 HLH 時，具有重要參考價值。

研究證實，無論何種原因造成肝細胞受損、壞死或膜通透性增加，均能導致血清ADA活性增高[13]。在本研究中，肝功能異常的EBV-HLH患者ADA水平高于肝功能異常的患者，且肝功能正常的EBV-HLH患者與健康體檢者血清ADA水平比較，差異有統計學意義。說明在噬血細胞綜合征中，ADA的分泌增加不僅來源于肝細胞的破壞，而且來源于淋巴細胞的釋放增加。可能的機制是在EBV-HLH中， EB病毒主要感染CD8+T細胞亞群，而在慢性活動性EBV感染中，EB病毒主要侵犯CD4+T細胞亞群或NK細胞[14]。EBV作用于不同的宿主細胞，可能是兩種EBV相關性疾病發病機制和臨床特征不同的重要基礎。Moreno等[15]研究發現，在T細胞和巨噬細胞活化過程中，ADA結合CD26分子產生共刺激信號，使Th1細胞顯著增加，釋放大量的促炎因子IFN-γ、TNF-α及IL-6。同時ADA受IL-2、IL-12的正向調控。本研究發現，EBV-HLH患兒ADA水平顯著升高，提示T淋巴細胞免疫在EBV-HLH的發病機制中發揮著重要作用，為噬血細胞綜合征中細胞因子風暴及Th1過度激活提供更有力的理論依據[16]。

綜上所述，本研究肯定ADA 在EBV-HLH患者輔助診斷中的價值，且在鑒別CAEBV是否進展為 EBV-HLH時，具有重要意義。ADA活性有助于判斷EBV-HLH患者預后情況。因而，ADA 檢測可以成為EBV-HLH患者的一項常規輔助檢查，可以更好地診斷疾病并反映患者病情的發展。本研究仍然存在很多不足，如病例數偏小，為單中心觀察性臨床研究，且ADA對EBV-HLH的診斷價值未與其他指標如鐵蛋白、sCD25等做對比性研究，期待今后開展多中心、大樣本的研究來進一步證實。