小檗堿對葡萄糖誘導的HEPG2細胞功能的調節機制

李 威 張 旭 趙芳園 匡洪影 劉婷婷

近年來由于人們生活習慣的變化，糖尿病發生率逐年增加，已經成為危害健康的主要疾病之一[1]。糖尿病患者較高的血糖水平對肝功能有重要的影響，在2型糖尿病患者中非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發生率高達34%～74%[2]。較高的血糖水平可能導致肝臟細胞中活性氧簇水平的升高及炎性因子表達水平的異常，從而引起肝纖維化的發生[3]。降低高血糖對肝細胞功能的影響對提高糖尿病患者生活質量有重要意義。

中藥黃連是中醫治療肝病的常用藥,而小檗堿是黃連的主要有效成分之一，臨床和實驗研究均發現小檗堿具有明確的降糖、調脂作用[4,5]。因此筆者推測，小檗堿可能對由高血糖造成的肝細胞功能異常有治療作用。本研究采用小檗堿處理經高濃度葡萄糖誘導的HEPG2細胞，觀察小檗堿作用后細胞的活力、脂代謝能力、氧化應激水平及炎性因子表達水平的變化，探討小檗堿對高濃度葡萄糖誘導的體外培養HEPG2細胞功能的調節機制。

材料與方法

1.實驗材料:實驗用人源肝臟HEPG2細胞系購自上海繼和生物科技有限公司，培養于含10% FBS的1640培養液中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。48h換液1次，2～3天傳代1次，待細胞穩定生長后用于后續研究。

2.藥品及試劑：實驗用小檗堿(上海源葉生物公司，批號：B21379)、葡萄糖(美國Sigma公司，批號：G7021-100G)、油酸鈉(美國Sigma公司，批號：Q7501-10G)、尼羅紅(美國Sigma公司，批號：72485)、細胞活性氧檢測試劑盒(中國碧云天公司，批號：S0033)、IL-6檢測試劑盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批號：DECO0291]、TNF-α檢測試劑盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批號：DECO0038]、PAI-1檢測試劑盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批號：DECO1754]、SREBP-1C抗體(英國Abcam公司，批號：ab28481)、FAS(英國Abcam公司，批號：ab22759)、SCD(英國Abcam公司，批號：ab39969)、AMPK(英國Abcam公司，批號：ab 3759)、P-AMPK(美國Cell signaling公司，批號：500815)、ACC(英國Abcam公司，批號：ab 72046)、P-ACC(ser79)(美國Cell signaling公司，批號：118185)、ACTINβ抗體(美國Santa Cruz公司，批號：sc-70319)。

3.實驗主要儀器：M7000熒光顯微鏡(美國Evos公司)；LC480實時定量PCR儀(美國Roch公司)；ELX800全自動酶標儀(美國Biotek公司)；凝GelDoc EZ膠成像系統(美國Biored公司)。

4.小檗堿藥物作用濃度的確定:正式實驗前，使用96孔板培養HEPG2細胞待細胞鋪滿板底后，按照濃度梯度分別向培養液中加入終濃度為0、10、20、40、80、160μmol/L的小檗堿，采用CCK8法檢測不同濃度小檗堿作用24h后細胞活力變化，使用GraphPad Prism 7軟件計算得到小檗堿培養HEPG2細胞24h的IC50值為71.21μmol/L。為了在不影響細胞正常生長的情況下研究小檗堿的藥效機制，在后續研究中以小檗堿IC50濃度的50%即35μmol/L作為小檗堿的最高作用濃度。

5.實驗分組及藥物處理:體外培養的HEPG2細胞隨機分為5組，即對照組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組。對照組為不加葡萄糖及小檗堿的正常細胞，其余4組參照文獻[6]，均加入終濃度為25mmol/L的葡萄糖。高劑量組細胞在加入葡萄糖的同時還加入終濃度為35μmol/L(50% IC50)的小檗堿，并按照小檗堿終濃度50%遞減的原則設立中劑量組(小檗堿終濃度18μmol/L)及低劑量組(小檗堿終濃度9μmol/L)。各組細胞培養24h后，收集細胞用于后續檢測。

6.體外培養HEPG2細胞脂代謝能力檢測：各組部分細胞在培養液中加入終濃度為200μmol/L油酸鈉， 24h培養結束后，使用終濃度為0.5μg/ml的尼羅紅對細胞內的脂類物質染色30min，部分細胞經Hochest33342復染，于熒光顯微鏡下對細胞590nm熒光強度進行拍照比較；剩余細胞經消化收集后使用流式細胞儀檢測細胞內590nm紅色熒光強度。

7.體外培養HEPG2細胞活性氧簇水平檢測：細胞活性氧檢測利用DCFH-DA探針對細胞內ROS進行標記。細胞終止培養后加入0.5ml 10μmol/L的DCFH-DA探針，于37℃下孵育45min，部分細胞經Hochest33342復染后對530nm綠色熒光強度進行拍照比較；其余細胞經消化收集，使用流式細胞儀檢測525nm細胞熒光強度。

8.細胞內炎性因子表達水平檢測：各組細胞培養結束后，使用RIPA裂解液冰浴狀態下裂解細胞，收集蛋白裂解液，經BCA法測定總蛋白濃度后，采用ELISA試劑盒按照說明書對樣本中相應因子濃度進行檢測，得到的結果與樣本總蛋白濃度做比值后則為單位質量細胞中炎性相關因子IL-6、TNF-α及PAI-1的表達水平。

9.實時定量PCR：各組細胞在培養結束后使用Trizol法抽提細胞內總RNA，使用反轉錄酶對mRNA進行反轉錄后，使用SYBR Green染料法及LC480實時定量熒光PCR儀對目標基因進行擴增，采用2-ΔΔCT法計算目標基因的相對表達水平，各基因引物序列詳見表1。

10.蛋白印跡實驗:各組細胞在藥物處理完成后使用RIPA裂解液冰浴狀態下裂解，按每組每個指標50μg總蛋白的標準經電泳轉印過程將凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上，經相應抗體孵育后加入ECL發光液，使用凝膠成像系統對進行放射自顯影檢測，所獲得的圖像使用軟件分析密度與面積，目標蛋白的相對相對表達水平=目標基因密度×面積/同組ACTINβ密度×面積。

表1 引物序列

結 果

1.小檗堿對HEPG2細胞脂肪代謝功能的影響:用尼羅紅染色的方法檢測細胞內脂類物質的殘留水平的結果表明，葡萄糖誘導后的HEPG2細胞中脂類物質蓄積水平顯著上升。流式細胞儀檢測結果也表明，與對照組比較，模型組細胞紅色熒光強度顯著增強(對照組3734.33±191.98，模型組27836.00±1716.34，P<0.01)。而小檗堿能以劑量依賴方式降低細胞內脂類物質水平，隨著小檗堿終濃度的提高細胞內紅色熒光強度逐漸降低(圖1)，且與模型組比較，各濃度小檗堿作用后細胞熒光強度的變化差異均有統計學意義(低劑量組16049.33±907.52，P<0.01；中劑量組11717.00±182.79，P<0.01；高劑量組4922.33±161.57，P<0.01)。

圖1、HEPG2細胞尼羅紅染色結果及流式細胞檢測直方圖葡萄糖誘導后與對照組比較，模型組細胞尼羅紅染色熒光強度增加，流式細胞儀檢測結果峰明顯右移；隨著小檗堿濃度的增加尼羅紅染色后的熒光強度逐漸降低，流式細胞儀檢測結果峰值與模型組比較逐漸左移

2.小檗堿對HEPG2細胞脂肪代謝相關因子表達水平的影響:各組細胞中脂代謝相關關鍵因子的mRNA及蛋白表達水平的檢測結果表明，與對照組比較，模型組細胞中膽固醇調節元件結合蛋白1(SREBP-1)及脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表達水平顯著升高而硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)mRNA的表達水平顯著降低；小檗堿以劑量依賴方式降低模型細胞中SREBP-1C及FAS mRNA的表達水平同時提高了SCD mRNA的表達水平，在中劑量組及高劑量組中表現的極為顯著(圖2A)。與對照組比較，模型組細胞中SREBP-1C及FAS的蛋白表達水平顯著升高而SCD蛋白表達水平顯著降低(圖2B)。小檗堿以劑量依賴的方式顯著降低模型組細胞中SREBP-1C蛋白表達水平，同時顯著提高葡萄糖誘導的HEPG2細胞中SCD的蛋白表達水平，但小檗堿對HEPG2細胞中FAS蛋白表達水平的影響未發現明顯的劑量依賴特征(圖2C)。

圖2 脂代謝相關因子mRNA及蛋白表達水平檢測A.脂代謝關鍵因子mRNA表達水平檢測；B.關鍵因子蛋白表達水平檢測；C.蛋白表達水平灰度分析;與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.小檗堿對HEPG2細胞ROS水平的影響：依據 “二次打擊學說”，肝細胞脂類物質沉積可能影響細胞內氧化應激水平及活性氧簇(ROS)的代謝平衡。本研究對各組細胞ROS的水平的檢測結果表明，經葡萄糖誘導后，體外培養的HEPG2細胞活性氧簇水平顯著上升，與對照組比較，模型組細胞DCFH-DA染色后流式細胞儀檢測到的熒光強度顯著增強(對照組1071.00±53.00，模型組5609.50±231.51，P<0.01)。小檗堿以計量依賴的方式降低細胞內的ROS水平，隨著小檗堿終濃度的提高細胞內活性氧簇水平逐漸降低，細胞平均熒光強度逐漸下降，與模型組比較各濃度小檗堿作用后流式細胞儀檢測到的細胞熒光強度差異均有統計學意義(低劑量組4460.53±208.57，P<0.01；中劑量組2708.00±33.12，P<0.01；高劑量組1309.82±170.50，P<0.01)，詳見圖3。

圖3 HEPG2細胞內ROS水平檢測及流式細胞直方圖(DCFH-DA染色，×100)葡萄糖誘導后與對照組比較，模型組細胞綠色熒光強度增加，流式細胞儀檢測結果峰明顯右移；隨著小檗堿濃度的增加綠色熒光強度逐漸降低，流式細胞儀檢測結果峰值與模型組比較逐漸左移

4.小檗堿對HEPG2細胞氧化應激相關因子表達水平的影響:各組細胞中氧化應激相關的關鍵因子mRNA表達水平的檢測結果表明，細胞內抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSR)及過氧化氫酶(CAT)的mRNA表達水平在葡萄糖誘導后均顯著下降，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。而小檗堿作用后SOD、GSR及CAT的mRNA表達水平均顯著上調，并且隨著小檗堿終濃度的提高上調的幅度愈加明顯(圖4)。

圖4 細胞內抗氧化因子mRNA表達水平A.SOD;B.GSR;C.CAT；與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

5.小檗堿對HEPG2細胞炎性因子表達水平的影響：模型組HEPG2細胞中白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)的水平較對照組顯著升高(P<0.01)。而小檗堿對這種高濃度葡萄糖造成的炎性因子表達的異常有明顯的抑制作用。中劑量及高劑量的小檗堿能夠顯著降低模型組細胞中IL-6的表達水平；同時高中低劑量的小檗堿均能夠顯著降低TNF-α的表達水平；而對細胞內PAI-1表達水平的顯著抑制作用則只在高劑量小檗堿作用時被觀察到(表2)。

表2 細胞內炎性因子表達水平

與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,ΔP<0.01

6.小檗堿對HEPG2細胞AMPK信號通路的調節:與對照組比較，模型組細胞AMPK因子mRNA的表達水平沒有顯著變化而ACC因子mRNA的表達水平則顯著降低。與模型組比較，不同終濃度的小檗堿均能夠顯著提高AMPK及ACC mRNA的表達水平(圖5A)。蛋白印跡法檢測結果表明，模型組細胞中AMPK、P-AMPK、ACC及P-ACC的表達水平與空白組比較，差異均無統計學意義(圖5B)。與模型組比較，高中低濃度的小檗堿均能夠顯著提高AMPK及ACC的蛋白表達水平及這兩個關鍵因子的蛋白磷酸化水平，說明小檗堿對體外培養的HEPG2細胞內的AMPK信號通路有明確的激活作用(圖5C)。

圖5 AMPK信號通路因子mRNA及蛋白表達A.AMPK信號通路關鍵因子mRNA表達水平檢測；B.關鍵因子蛋白表達水平檢測；C.蛋白表達水平灰度分析。與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

討 論

在2型糖尿病的并發癥中，盡管非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)流行比例達34%～74%，但由于其癥狀隱蔽，長期以來一直為人們所忽視[7]。臨床研究發現，小檗堿不僅能改善2型糖尿病患者胰島素抵抗、降低血糖并且對脂質代謝紊亂也具有調節作用[8]。而本研究結果表明，小檗堿能通過調節細胞內脂代謝相關因子SREBP-1、SCD及FAS的表達水平進而顯著降低高濃度葡萄糖所引起的細胞內脂類物質積累。肝細胞內的脂肪沉積不僅有影響肝細胞的正常代謝功能還會引起細胞氧化應激水平的變化，由于脂類物質積累所造成的肝細胞內ROS水平的異常升高可能造成肝細胞的氧化應激損傷[9]。本研究發現，小檗堿能夠顯著降低細胞內的ROS水平，通過激活細胞內抗氧化因子的表達水平保護細胞免于高濃度葡萄糖造成的氧化應激損傷，說明小檗堿具有一定的抗氧化功能。

由于高血糖引起的非酒精性肝損傷及肝臟細胞的脂類物質沉積不僅對肝臟功能產生影響，還可能導致肝臟的纖維化等不可逆的病理性改變，在這一過程中肝臟自身分泌的炎性因子起到重要的作用[10]。小檗堿能夠降低非酒精性肝損傷模型大鼠炎性因子水平，保護模型動物肝臟免于纖維化損傷[11,12]。同樣在本研究中，小檗堿也能夠顯著降低葡萄糖誘導后HEPG2細胞內源性的炎性因子表達水平，提示小檗堿很可能通過調節肝細胞炎性因子的表達來緩解非酒精性肝損傷造成的肝臟纖維化改變。

小檗堿對AMPK信號通路有顯著的激活作用，AMPK信號通路不僅與細胞的糖脂代謝關系密切，還參與細胞氧化應激及炎性因子表達的調節。AMPK通路的激活能夠通過抑制肝臟細胞SREBP-1C因子的表達水平抑制肝臟組織脂肪變性的發生，同時在心肌細胞中二甲雙胍通過激活AMPK信號通路上調心肌細胞抗氧化因子的表達水平抵抗缺血-再灌注對心臟的損傷[13,14]。本研究發現，小檗堿對體外培養的HEPG2細胞AMPK信號通路有顯著的激活作用，隨著小檗堿終濃度的提高，AMPK及ACC的核酸、蛋白及磷酸化蛋白的表達水平顯著上升。AMPK信號通路的激活，高濃度葡萄糖誘導的HEPG2細胞的脂類物質代謝能力、細胞內活性氧簇水平及異常的炎性因子表達水平的異常現象都有所緩解，并且這種變化與小檗堿終濃度的變化及AMPK信號通路的活化程度密切相關。

綜上所述，本研究中體外培養HEPG2細胞經過高濃度葡萄糖誘導，在脂類物質代謝、細胞氧化應激水平及炎性因子分泌水平等方面都出現了類似非酒精性肝損傷的病理表現。小檗堿通過劑量依賴的方式，激活AMPK信號通路緩解了由于體外培養的HEPG2細胞高濃度葡萄糖誘導造成的功能異常。基于AMPK信號通路對細胞氧化應激水平及脂代謝功能的調節作用，推測AMPK信號通路很可能是小檗堿緩解非酒精性肝損傷臨床表征的藥理作用機制，而對小檗堿治療非酒精性肝損傷藥理機制的深入研究，對拓展中醫藥治療肝臟疾病方面的應用具有積極的意義。