熱休克蛋白70在家族性腺瘤性息肉病中的表達及意義

沈曉東 張 天 宋 文

FAP是一種常染色體顯性遺傳病，中國人發生率約是1/10000，受累個體在青春期長出成千上萬的大腸息肉，未經治療則100%癌變,患者將無一例外死于大腸癌[1]。FAP的治療主要是全結腸切除或全結腸及直腸切除，但手術后并發癥較多，患者生活質量差，并且術后仍可能復發轉移或其他部位形成惡性腫瘤等風險，需要接受非手術治療，故FAP免疫治療等非手術治療方面的研究非常必要[2]。目前研究表明，FAP發病與抑癌基因APC突變有關[3]，大多數APC基因突變使APC蛋白呈“截短”改變，導致其結合β-catenin 的區域異常，引起β-catenin降解障礙，細胞質內β-catenin大量集聚，進入細胞核后與TCF因子結合并激活轉錄，誘發腸道息肉形成及癌變。Apc基因敲除小鼠ApcΔ716/+是國際公認的研究人FAP的小鼠模型，具有高度遺傳穩定性，廣泛應用于人FAP方面的的研究[4～6]。

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是細胞受到高熱等有害因素刺激時大量表達的一類特殊應激蛋白，其主要作用是通過與細胞內變性蛋白質結合而維持其正常的構象及功能[7]。根據同源程度及分子量大小將HSP家族成員分為HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP等10余種，其中HSP70最受研究者們關注，它在正常細胞中表達水平較低，但細胞受到應激時合成量最多、表達水平最高，特別是惡性腫瘤的缺氧、酸中毒和營養缺乏等不良環境，可誘導腫瘤細胞大量表達HSP70[8]；HSP70作為“分子伴侶”c-Myc等基因突變后的產物相互作用，穩定腫瘤細胞異常增殖[9]；腫瘤來源的HSP70 具有強大的免疫原性和腫瘤特異性, 因而HSP70可能在FAP息肉發生、惡變及免疫反應中發揮重要作用[10]。

近年來研究表明HSP70在許多腫瘤中大量表達，并且在腫瘤免疫治療中發揮重要作用，但在FAP腸道息肉發生、發展中的表達情況及作用目前國內外尚未見報道[11]。本研究采用ApcΔ716/+小鼠作為FAP模型鼠，研究不同周齡的小鼠腸道息肉HSP70表達的變化，從而明確HSP70在FAP發生、發展中的作用，為HSP70應用于FAP的抑制息肉癌變、延緩病情發展及免疫治療提供依據。

材料與方法

1.材料:鼠抗人HSP70單克隆抗體(ab2787)及辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠多克隆抗體 (ab6728)由英國艾博抗公司提供，增強化學發光試劑盒由英國阿默舍姆制藥生物技術公司提供，Trizol試劑盒由美國英杰生命技術公司提供，標第1鏈合成系統Ⅱ由美國賽默飛生命科學公司提供。SYBR Green PCR 預混液及ABI PRISM?7000 序列檢測系統由美國PE應用生物系統公司提供。其他試劑及儀器均為實驗研究使用。

2.實驗動物：ApcΔ716/+(C57BL/6)小鼠由Oshima教授提供，SPF環境中飼養，ApcΔ716/+雄性小鼠與野生型雌性小鼠進行交配，通過基因鑒定選出ApcΔ716/+小鼠作為本研究使用[5，6]。

3.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉數目、大小及良惡性判定:分別于1～16周選取各周齡ApcΔ716/+小鼠，每周6只共96只，不分性別，頸椎脫臼法處死小鼠，分離出腸道，剪開腸道，甲醛溶液固定。體視顯微鏡×20視野，觀測并記錄每個息肉；觀測完成后將腸組織卷起，常規石蠟包埋及切片；通過HE染色判斷息肉良惡性，并與小鼠周齡及息肉的大小對照。通過體視顯微鏡觀察及HE染色等方法確定息肉開始出現的周齡為4周,絕大部分直徑為0.5～1.0mm，全部為良性腺瘤性息肉；息肉開始癌變的周齡為8周，癌變的息肉直徑多>3.0mm,尤其是≥4.0mm者均發生癌變。

4.ApcΔ716/+小鼠腸息肉HSP70免疫組織化學染色:選取4周、8周、12周ApcΔ716/+小鼠,每組6只,分離整個腸道并依次固定及石蠟包埋；5μm切片，水化，通過HE染色選取癌變的息肉；3%雙氧水過氧化物酶阻斷，微波抗原修復，山羊血清封閉，滴加HSP70一抗， 4℃密封過夜，滴加相應二抗， 37℃溫育30min，各步驟間PBS振洗， DAB顯色、復染、脫水、透明及封片。免疫組化染色陽性判定標準：棕黃色顆粒沉積的部位為染色陽性，腫瘤細胞主要是細胞核著色，部分腫瘤細胞細胞質輕微著色，少部分正常上皮細胞細胞質和細胞膜輕微著色。HSP70的相對表達量由染色細胞比率及著色強度的乘積來判定，每個切片在×400視野下在典型部位隨機選取10個視野，各視野共檢測100個細胞[12]。染色細胞陽性比例判斷標準：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；染色強度的判斷標準：細胞內無染色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。由兩名病理科醫生雙盲下獨立評分。

5.Western blot法檢測ApcΔ716/+小鼠腸道息肉中HSP70的表達:采取4周正常腸黏膜、0.5mm剛形成的腸道良性息肉及8周小鼠腸道4.0mm以上最大的息肉、12周小鼠5.0mm癌變息肉(8周及12周標本留取小部分組織通過HE染色證實已經癌變)的細胞提取液進行10% SDS-PAGE凝膠電泳及半干式轉膜，一抗選用鼠抗人HSP70單克隆抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠多克隆抗，增強化學發光試劑盒顯像。

6.RT-PCR法檢測ApcΔ716/+小鼠息肉HSP70的 mRNA的表達:選取4周、8周、12周ApcΔ716/+小鼠各6只，處死小鼠，無RNA酶狀態下分離腸道，切取4周0.5mm左右息肉、8周4.0mm以上最大的息肉、12周5.0mm息肉(8周及12周標本留取小部分組織通過HE染色證實已經癌變)及4周正常腸黏膜，Trizol 試劑盒提取息肉及腸黏膜的總RNA，操作方法依照Trizol 試劑盒的使用說明書；應用標第1鏈合成系統Ⅱ試劑盒合成相應cDNA, HSP70引物序列：上游引物：5′-GAAGGTGCTGGACAAGTGC-3′，下游引物：5′-GCCAGCAGAGGCCTCTAATC-3′[13]。PCR擴增應用SYBR Green PCR預混液，ABI PRISM?7000 序列檢測系統檢測結果，內參選用β-actin。

7.統計學方法:應用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料采用方差分析檢驗，組間比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉發生及發展情況:通過對1～16周齡共96只小鼠腸道息肉的體視顯微鏡觀察及HE染色發現，小鼠腸道1～3周基本無腸道息肉，于4周左右腸道開始出現息肉，詳見表1，息肉均為剛形成的良性腺瘤性息肉，體積較小約0.5～1.0mm，詳見圖1；5～7周小鼠腸道息肉大量形成、快速增大，但均為良性腺瘤性息肉；8周齡小鼠腸道息肉大量形成,部分較大(>3.0mm)的息肉開始出現癌變，發展成腸腺癌，直徑>4.0mm的息肉絕大部分癌變； 9～11周小鼠腸道息肉形成速度明顯減慢，但息肉體積進行性增大，呈現浸潤性生長；12周齡腸道息肉數目進一步增加，體積也進一步增大，癌變的息肉也大幅度增加，部分小鼠出現腸梗阻、腹腔積液、惡病質等并發癥，小鼠開始出現死亡；13～15周小鼠腸道仍有少許新發腸道息肉，體積進行性增大,最大者超過10mm，小鼠大量死亡；16周內絕大部分小鼠死亡，平均生存期限14.12±6.70周，死亡時小鼠腸道息肉總數為90.6±13.8。因ApcΔ716/+小鼠4周左右開始出現息肉，8周左右較大的息肉開始出現癌變，12周左右小鼠開始出現死亡，故選取4、8和12周小鼠檢測HSP70的表達情況。正常小鼠腸道作為對照，在正常小鼠腸道內未見息肉。

表1 ApcΔ716/+小鼠腸道息肉總數惡變息肉數及HSP70相對表達量

與4周比較,*P=0.000；與8周比較,#P>0.05，ΔP=0.000

圖1 4周、8周及12周ApcΔ716/+小鼠腸息肉及正常小鼠腸道的體視顯微鏡觀察A.正常；B.4周；C.8周；D.12周；標尺:2mm

2.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉的HSP70免疫組織化學染色：不同周齡ApcΔ716/+小鼠腸道息肉HSP70的相對表達量明顯不同(F=167.423,P=0.000)，詳見圖2。HSP70在4周時腸息肉內相對表達量很低(1.60±0.37)，僅見少數HSP70陽性細胞，著色強度也很弱；8周時部分息肉開始出現癌變，HSP70相對表達量明顯升高(6.37±0.56)，與4周時比較差異有統計學意義(P=0.000)；12周時癌變的息肉快速增多，并呈浸潤性生長，HSP70相對表達量升高(7.02±0.70)，與4周時比較差異有統計學意義(P=0.000)，但與8周時比較略有升高。正常小鼠腸道HSP70免疫組織化學染色作為對照，在正常小鼠腸道中未見明顯HSP70染色陽性細胞。

圖2 ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤性息肉及正常小鼠腸道的HSP70免疫組織化學染色A.正常；B.4周；C.8周；D.12周；標尺為50μm

3.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉的HSP70蛋白表達：正常腸黏膜HSP70表達量極低，條帶僅隱約可見；4周時息肉開始出現，HSP70表達量略升高，但蛋白條帶仍然較弱；而8周及12周腸道息肉的HSP70蛋白條帶明顯增強，與正常腸黏膜及4周時腸息肉比較明顯不同，詳見圖3。

圖3 HSP70在不同周齡ApcΔ716/+小鼠腸道息肉及正常腸黏膜(M)中的表達

4.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉的HSP70 RT-PCR結果：不同周齡小鼠腸道息肉HSP70的mRNA相對值也明顯不同(F=62.661,P=0.000),詳見圖4。正常腸黏膜HSP70的mRNA表達量極低,為0.06±0.03,4周腸息肉開始出現時HSP70的mRNA表達量略有升高,為0.17±0.09,與正常黏膜比較差異無統計學意義；8周腸道癌變息肉HSP70的mRNA表達量明顯升高(0.69±0.14)，與4周時腸息肉比較差異有統計學意義；12周時腸息肉內HSP70的mRNA表達量為0.82±0.16,較4周息肉明顯升高,但較8周息肉僅略有升高，差異無統計學意義(P<0.05)。

圖4 ApcΔ716/+小鼠腸道息肉HSP70的mRNA相對值

討 論

FAP患者息肉終生癌變率幾乎是100%，但如果及時發現、及時治療可以預防息肉癌變，故預防FAP患者息肉癌變非常重要[14]。目前研究表明HSP70在許多惡性腫瘤發生、發展及治療中發揮重要的作用，而且HSP70對惡性腫瘤的免疫治療已進入臨床試驗階段[6～9,15]； HSP70與惡性腫瘤放、化療敏感度低下有關[16]。上述一系列研究說明，HSP70參與惡性腫瘤的發生、發展、診斷、治療、耐藥及預后等一系列臨床過程，適合作為FAP息肉癌變、發展惡化及免疫治療等方面的靶點而深入研究。

本研究顯示，在4周左右ApcΔ716/+小鼠開始出現腸道息肉，息肉開始形成時均為良性腺瘤性息肉，通過免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡分析及RT-PCR等實驗方法證明，4周時0.5mm左右剛形成的息肉HSP70表達較正常腸黏膜略有升高，但表達仍較低，差異無統計學意義，說明HSP70在FAP息肉形成過程中作用不明顯。8周時小鼠腸道息肉開始出現癌變，息肉癌變組織中HSP70表達顯著升高，說明HSP70在息肉癌變中發揮重要的作用。12周時ApcΔ716/+小鼠很多息肉已經癌變，發展成腸腺癌，并呈浸潤性生長，其HSP70表達較4周息肉顯著升高，較8周息肉開始癌變時略有升高，提示HSP70在結直腸癌發展中也發揮重要作用。以上結果表明，HSP70在息肉開始癌變時及癌變后持續升高，直至小鼠死亡，說明HSP70在息肉癌變及腸癌形成后的生長、浸潤及轉移等發展過程中有重要作用。由于FAP具備典型的息肉-腺瘤-癌變過程，是大腸癌發病機制研究的最佳樣本，所以通過上述結果，可推測HSP70在結直腸癌形成及發展過程中也具有重要作用。

HSP70參與FAP息肉癌變及腸癌發展的機制尚不清楚，目前研究表明，WNT信號通路中β-catenin 等活性升高是FAP息肉癌變的重要特征，HSP70通過活化WNT信號通路，提高β-catenin等蛋白數量及穩定性，引起β-catenin轉錄活性增高，促進腫瘤細胞的生長及增殖[17，18]；HSP70在腫瘤細胞中能通過分子伴侶作用減輕蛋白毒性應激反應，使腫瘤細胞在營養缺乏、蛋白毒性應激、缺氧等不良生存環境中存活[19]；HSP70使腫瘤細胞抵抗正常細胞凋亡信號[20]。綜合上述研究可推測HSP70可能通過使WNT信號通路中β-catenin等蛋白數量及活性升高、減輕蛋白毒性應激反應及抑制腫瘤細胞凋亡等作用機制，促進FAP息肉癌變及腸癌進展，需要進一步研究明確HSP70 促進FAP腸息肉癌變中的具體作用機制。

綜上所述，本研究中4周息肉開始出現時HSP70表達略有升高，在8周息肉開始癌變及12周腸癌生長浸潤時HSP70表達持續性顯著升高，提示HSP70在息肉的形成過程中作用不明顯，但在腸息肉癌變及腸癌浸潤生長發揮重要的作用。本研究探索了HSP70在FAP腸道息肉中表達的變化情況及其意義，為FAP患者預防息肉癌變及結直腸癌免疫治療提供新策略。