鼻腔用冷敷凝膠的急性毒性及纖毛毒性實驗研究

嚴國鴻，林亞娟，胡博志，徐偉，王曉穎

(1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；3.藍佳堂生物醫藥<福建>有限公司，福建 福州 350007)

鼻黏膜容易受到外來有害物質或致敏性物質的侵擾，從而引發鼻充血、鼻炎，繼而可能會造成耳部不適、干擾聽覺、影響發音，甚至會影響睡眠。配合藥物治療，緩解局部癥狀的鼻腔用敷料成為臨床需求之一[1-3]。藍佳堂生物醫藥(福建)有限公司研發的由卡波姆、聚乙二醇、卵黃分離物、薄荷腦等組成的鼻腔用冷敷凝膠Ⅱ型(簡稱鼻腔凝膠)，針對鼻黏膜局部癥狀使用，令使用部位的毛細血管收縮，減輕局部充血，黏膜神經末梢的敏感性降低，可以達到冷敷的目的；并有助于緩解急慢性鼻炎、過敏性鼻炎、鼻竇炎及普通感冒等引起的不適癥狀(如：鼻塞、鼻痛、鼻干癢、流鼻涕、打噴嚏等)，也可用于鼻竇術后或放療后的冷敷護理，適合臨床需求。

鼻腔制劑或敷料使用后，由于其組成成分的影響，鼻纖毛運動常會受到不同程度的損害，甚至可使纖毛運動不可逆的停止，影響鼻纖毛的清除功能，故對鼻纖毛毒性的影響是鼻腔制劑或敷料的重要研究內容之一[4-5]。本實驗采用牛蛙上顎離體法，對鼻腔凝膠的鼻纖毛毒性進行了研究[6-7]，并以高于臨床給藥濃度100倍的鼻腔凝膠濃縮液，測定該鼻腔凝膠的急性毒性，為鼻腔冷敷凝膠的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 ICR小鼠，清潔級，雌性，體重24～33 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2016-0002。

1.2 試劑 冷敷凝膠Ⅱ型(鼻腔)[藍佳堂生物醫藥(福建)有限公司,批號：L01332101]；脫氧膽酸鈉(美侖生物有限公司，批號：S0802A)。

1.3 儀器 Nikon YS100型生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 急性毒性評價

2.1.1 急性毒性試驗預試驗 取20只ICR小鼠，雌雄各半。給藥前禁食不禁水 12 h 后進行稱重。體重相近的4只為一組，共5組。再隨機從各組中取2只作為給藥組，剩余10只作為生理鹽水對照組。按小鼠灌胃最大給藥劑量為0.3 mL/10 g，最多不超過1.0 mL/只，灌胃鼻腔凝膠，其濃度為臨床制劑濃度的100倍。給藥后記錄小鼠體重、外觀、行為、飲食、分泌物、排泄物的變化。

2.1.2 小鼠一日最大耐受量(MTD)的測定 因鼻腔凝膠用最大允許濃度和最大允許容量給予動物時仍未能測出LD50，為進一步研究該鼻腔凝膠的毒性情況，做一日最大耐受量(MTD)測定。取 ICR小鼠20只，按0.3 mL/10 g劑量進行灌胃給藥，間隔6 h給藥1次。給藥3次后連續觀察7 d，記錄小鼠給藥后外觀(體重、皮膚毛發、眼和黏膜的變化)、行為、飲食、分泌物、排泄物及其中毒和死亡情況，生理鹽水組按上述同法操作。

2.2 鼻纖毛毒性

2.2.1 鼻纖毛毒性考察方法[6-7]為考察鼻腔凝膠對纖毛運動的影響，選擇牛蛙上顎黏膜作為動物模型。將牛蛙脊髓搗毀后，仰臥固定于自制蛙板上，使口腔張開，用止血鉗牽拉，用膠頭滴管往上顎黏膜滴加3滴鼻腔凝膠，使黏膜完全被藥物淹沒。接觸10 min后用手術剪小心分離上顎黏膜，分割成3 mm×3 mm的黏膜。用生理鹽水洗去血塊及雜物，纖毛面向上平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于40×10倍的光學顯微鏡下觀察纖毛擺動及脫落情況。觀察后立即將載玻片擱置于含有飽和蒸餾水的層析缸中，密閉 (環境溫度20～25 ℃，水蒸氣近飽和狀態)。黏膜表面間隔30 min給藥0.2 mL，每隔20 min從展開缸取出觀察，直至纖毛停止運動。將從給鼻腔凝膠開始到纖毛停止擺動的時間(PVD)記錄下來。纖毛停止擺動后，用生理鹽水沖洗黏膜上的鼻腔凝膠，繼續觀察纖毛擺動可否恢復，并記錄下纖毛恢復運動持續時間。另取陽性對照組(1%去氧膽酸鈉)、空白對照組(生理鹽水)處理方法同上，觀察其纖毛擺動情況。

2.2.2 纖毛毒性評價方法[8]纖毛持續運動時間的百分率(PPV)=鼻腔凝膠組(或陽性對照組)的纖毛持續運動時間/生理鹽水對照組的纖毛持續運動時間。PPV 越高，表示鼻腔凝膠組(或陽性對照組)對纖毛運動影響越小，即對纖毛毒性越小。

3 結果

3.1 急毒性試驗評價

3.1.1 急性毒性試驗預試驗結果 小鼠給予鼻腔凝膠或生理鹽水后，均出現短暫靜臥，大約 1 h 后恢復正常，均無小鼠死亡情況。鼻腔凝膠組與生理鹽水組小鼠，大、小便顏色正常，毛色光澤。連續觀察7 d，分別于給予鼻腔凝膠或生理鹽水后每天同一時間稱量各組小鼠的體重。結果(見表 1)數據表明各劑量組小鼠體重與空白對照組比較無統計學差異(P>0.05)。給藥后 14 d 各組小鼠無死亡、無異常反應。處死小鼠，解剖后，檢測各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、胰腺、大腸、小腸等主要臟器體積、顏色、質地均無明顯改變，故無法測得 LD50。

3.1.2 小鼠MTD測定結果 給予鼻腔凝膠或生理鹽水后動物表現均無異常,除第 1 天小鼠灌胃后出現短暫不適，活動減少以外，均未見小鼠中毒與死亡。結果(見表2)表明鼻腔凝膠組小鼠體重與生理鹽水組比較無統計學差異(P> 0.05)。給予鼻腔凝膠或生理鹽水后7 d 各組小鼠均無死亡及任何異常反應。處死小鼠后觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、胰腺、大腸及小腸等主要臟器體積、顏色、質地均無明顯改變。本實驗給予小鼠的鼻腔凝膠濃度為成品濃度的100倍，日累積劑量為臨床成人擬推薦日用劑量的160倍。表明鼻腔凝膠型臨床應用的安全性較高。

表1 一日最大給藥量各組小鼠體重變化(n=20)

表2 一日最大耐受量各組小鼠體重變化(n=20)

3.2 鼻纖毛毒性試驗結果 顯微鏡下觀察結果顯示，生理鹽水組和鼻腔凝膠組纖毛清晰完整(如圖1A)，排列整齊，有規律地向同一方向擺動，纖毛運動活躍，呈“風吹麥浪”式擺動[8]，且擺動頻率極快；鼻腔凝膠組纖毛較清晰，纖毛運動較活躍(見圖1B)。給予脫氧膽酸鈉后，纖毛停止擺動、纖毛邊緣基本脫離，黏膜受損較嚴重，部分基部裸露(見圖1C)，表明脫氧膽酸鈉對黏膜組織有嚴重的破壞作用，對纖毛運動有嚴重的不可逆的抑制作用。

本實驗采用多次給藥牛蛙上顎黏膜，每隔30 min對牛蛙上顎黏膜滴加2 mL鼻腔凝膠，纖毛持續運動時間為(187.6±66.4)min，相對運動百分率為69.4%，結果見表3。當纖毛停止運動后，用生理鹽水沖洗黏膜上的鼻腔凝膠，纖毛恢復擺動記錄其恢復擺動時間為(23.6±6)min。說明該鼻腔凝膠對鼻纖毛的毒性較小，纖毛毒性可逆，可以應用于鼻腔局部。

表3 各組纖毛持續運動時間和持續運動百分率

4 討論

通過急性毒性實驗證明該鼻腔凝膠安全性良好，并且牛蛙黏膜纖毛實驗顯示單次使用后其對纖毛運動無影響。本實驗考慮鼻腔凝膠連續使用的問題，采用多次給藥方式，測得纖毛持續運動時間的百分率為69%，纖毛停止運動后，用生理鹽水沖洗后纖毛可以恢復擺動，說明對黏膜纖毛的損傷并不嚴重，但仍要注意合理的給藥間隔和給藥次數。

鼻腔凝膠為鼻腔用敷料，主要用于緩解鼻腔黏膜由于炎癥及感冒等引起的充血等不適，配合臨床藥物治療使用，減少患者的痛苦[9-10]。經測試，鼻腔凝膠安全性良好，對鼻纖毛的毒性小，對纖毛的影響具有可逆性，可以用于鼻腔局部，在臨床應用上有較好的應用前景。