AVPR2基因突變致X連鎖先天性腎性尿崩癥一例報告

劉竹楓，王文紅，張瑄，陳文玉

先天性腎性尿崩癥（congenital nephrogenic diabetes insipidus，CNDI）是一組遺傳異質(zhì)性單基因疾病，較少見，約占所有腎性尿崩癥（NDI）的10%，其發(fā)病機制主要是由于垂體后葉素分泌的抗利尿激素（arginine vasopressin，AVP）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑缺陷，導(dǎo)致腎小管遠端及集合管對AVP 反應(yīng)不敏感或無反應(yīng)。CNDI約90%為抗利尿激素受體2（AVPR2）基因突變所致，該基因為X連鎖隱性遺傳，其余10%由水通道蛋白2（AQP2）基因突變所致，為常染色體顯性或隱性遺傳。近年來，CNDI基因突變的遺傳及分子機制成為該領(lǐng)域的研究熱點，為該病在基因及分子水平上的診斷和治療提供了可能性。AVPR2基因突變導(dǎo)致的X連鎖CNDI的位點在逐漸增加，目前共發(fā)現(xiàn) 280 多 種AVPR2基 因 突 變［1］，中 國 發(fā) 現(xiàn) 32 個AVPR2基因位點突變，以錯義突變?yōu)橹鳎?29 個［2］。CNDI 多在嬰兒期發(fā)病，發(fā)病率較低，如臨床醫(yī)師不能充分認識，早期診斷及時治療，會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥，如生長發(fā)育落后，智力低下，腎功能不全，甚至嚴重的電解質(zhì)紊亂導(dǎo)致死亡。本研究報告1例確診為CNDI的患兒，通過臨床資料及基因檢測明確診斷并治療隨訪及文獻復(fù)習。

1 病例報告

1.1 病例資料 先證者 男，4 月齡。生后24 d 因鼻塞、喉中痰鳴2 d、發(fā)熱5 h，于2018 年1 月31 日入住我院新生兒科病房。體溫波動在39.1～40.5 ℃之間，物理降溫較難降至正常。個人史（即生產(chǎn)史）：系第1 胎第1 產(chǎn)，足月順產(chǎn)，否認宮內(nèi)窘迫及生后窒息史，母親孕期無異常。入院查體：體質(zhì)量3.5 kg，血壓65/45 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），體格發(fā)育欠佳，神志清、精神反應(yīng)可，呼吸平穩(wěn)，無浮腫、皮膚彈性尚可，心肺腹查體未見明顯異常，正常男性外生殖器，四肢肌力肌張力正常。血常規(guī)：血紅蛋白126 g/L，白細胞計數(shù)11.13×109/L，中性粒細胞計數(shù)（N）0.426，血小板計數(shù)283×109/L；靜脈血氣：酸堿度（pH）7.41，二氧化碳分壓［p（CO2）］34 mmHg，剩余堿（BEb）-2 mmol/L，血C反應(yīng)蛋白（CRP）、血沉（ESR）正常，3次血培養(yǎng)陰性、3次尿培養(yǎng)陰性。大便細菌培養(yǎng)陰性，病毒培養(yǎng)提示輪狀病毒陽性。血(1,3)-β-D葡聚糖：198.9 ng/L，提示真菌感染。電解質(zhì)多次提示高鈉高氯血癥：血鈉145～157 mmol/L，血氯114～119 mmol/L，肝腎功能大致正常，血肌酐31μmol/L，血尿素氮2.9 mmol/L。胸腹聯(lián)合X線片示雙肺紋理增粗，腹部未見異常。心電圖正常，腹部超聲肝脾腎未見異常。心臟超聲示卵圓孔未閉、房間隔缺損。頭部及垂體核磁顯示雙側(cè)額頂葉腦室旁白質(zhì)區(qū)片狀長T1、稍長T2 信號影，篩竇蝶竇黏膜增厚，垂體平掃未見異常。尿常規(guī)：多次尿比重1.000～1.010，鏡檢陰性。診斷：（1）新生兒肺炎。（2）真菌感染。（3）輪狀病毒腸炎。（4）高鈉高氯血癥原因待查。（5）卵圓孔未閉、房間隔缺損。入院后給予抗感染對癥支持治療，患兒體溫有下降趨勢，但高鈉高氯血癥難以糾正。入院后發(fā)現(xiàn)患兒喜飲水，尿量多。監(jiān)測飲水量550～800 mL/d，尿量750～1 050 mL/d，垂體核磁檢查未見異常（圖1A），結(jié)合病史考慮尿崩癥，家屬拒絕禁水-加壓素試驗及基因檢測，自動出院。2018 年 5 月 6 日因間斷發(fā)熱 18 d 第 2 次住院，入住我院腎臟病科。追問病史，患兒自上次出院后仍有多飲、多尿表現(xiàn)。先證者父母非近親婚配，檢測父母尿比重分別為1.020、1.025，除先證者外，患兒父母及其他家族成員否認疑似存在尿崩癥的臨床表現(xiàn)。復(fù)查頭部及垂體核磁顯示雙側(cè)額葉、頂葉腦室旁白質(zhì)區(qū)片狀稍長T1、稍長T2信號影較前范圍縮小，垂體蝶鞍不大，垂體形態(tài)未見異常，高度約4.1 mm，垂體后葉短T1 信號消失。垂體柄居中、無增粗。雙側(cè)海綿竇區(qū)未見異常信號影（圖1B）。征得患兒監(jiān)護人知情同意，并簽署知情同意書后行禁水-加壓素試驗（表1），禁水后每小時測尿比重，同時留尿常規(guī)、血液及尿液滲透壓，監(jiān)測6 h，患兒多次尿比重＜1.015，尿比重之差＜0.001，停止禁水試驗，行加壓素試驗，皮下注射垂體后葉素（0.2 IU/kg），重復(fù)上述操作，密切監(jiān)測患兒生命體征，患兒體質(zhì)量降低5%，尿滲透壓＜血滲透壓，尿比重＜1.015，兩次尿比重之差＜0.001，終止試驗。本患兒禁水-加壓素試驗結(jié)果支持腎性尿崩癥。

Fig.1 Pituitary MRI of the child with congenital renal diabetes insipidus圖1 CNDI患兒垂體核磁影像

1.2 基因檢測方法 為明確診斷，先證者及其父母行基因檢測。（1）目標序列捕獲與測序。抽取先證者及其父母靜脈血2 mL，采用德國Qiagen公司QIAamp DNA Blood Midi Kit 按照標準流程提取基因組DNA。利用美國Massachusetts 公司Covaris LE220 超聲波儀將基因組DNA 打斷成主帶為100～500 bp 小片段DNA，然后將打斷后的DNA 片段進行磁珠篩選，篩選后的主片段大小為150～200 bp，末端補平后，在3'端加腺嘌呤（A），使得DNA 片段能與3'端帶有胸腺嘧啶（T）的特殊接頭連接，從而完成單個受檢者的DNA 文庫。Non-Captured樣品進行LM-PCR反應(yīng)，純化，利用定制的基因片段捕獲探針（Roche NimbleGen，Madison，USA），與10～20個標記好的患者DNA文庫47 ℃雜交16～24 h，雜交結(jié)束后進行探針的洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進行Captured 樣品的LM-PCR 反應(yīng)。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和BMG 進行片段大小、濃度檢測，合格后將需要不同數(shù)據(jù)量的文庫進行pooling、定量；然后將pooling 文庫進行單鏈環(huán)化。環(huán)化后的文庫經(jīng)過make DNB 后利用高通量測序儀BGISEQ-500 連續(xù)雙向測序50個循環(huán)，并讀出原始測序數(shù)據(jù)。（2）序列分析。數(shù)據(jù)下機后進入信息分析部分。首先對下機的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進行測序質(zhì)量評估，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的reads。隨后用BWA軟件（Burrows Wheeler Aligner）與HG19/HG20進行序列比對，與此同時進行序列捕獲效果評價，用GATK 軟件進行 SNV（single nucletide variant）和 Indel（insertion and deletion）的查詢，生成目標區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進行數(shù)據(jù)庫（NCBI dbSNP，HapMap，1 000 human genome dataset 和database of 100 Chinese healthy adults）的比對，并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。（3）Sanger法測序驗證。對于所有發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上下游設(shè)計引物。進行PCR擴增，對產(chǎn)物做Sanger 測序，從而驗證基因芯片捕獲和高通量測序的結(jié)果。

Tab.1 The results of water deprivation vasopressin test of the child表1 患兒禁水-加壓素試驗結(jié)果

1.3 基因檢測結(jié)果 先證者AVPR2基因亞區(qū)發(fā)現(xiàn)1 處新發(fā)突變：c.359T＞G，為半合子突變，突變類型為錯義突變，導(dǎo)致氨基酸改變：p.Met120Arg，該基因位于X染色體上，先證者母親在AVPR2同樣的基因位點存在新發(fā)突變：c.359T＞G，為雜合突變，與先證者突變序列相同，受檢者父親無此突變，見圖2。理論上先證者母親為新發(fā)突變的攜帶者，先證者的AVPR2基因突變?yōu)樾掳l(fā)突變，來源于母親，表型和X 連鎖隱性遺傳性先天性尿崩癥相吻合。

1.4 治療及隨訪 給予患兒氫氯噻嗪2 mg/（kg·d），其尿量減少20%～30%，體溫降至正常，出院。患兒出院后目前調(diào)整為氫氯噻嗪聯(lián)合阿米洛利治療，門診隨訪1年，患兒存在生長發(fā)育落后，偶有低熱，尿量減少至30%～40%。

Fig.2 AVPR2 gene sequencing results圖2 AVPR2基因測序結(jié)果

2 討論

國外報道AVPR2基因突變所致的CNDI，大約25萬例男性中有1例發(fā)病［3］。一項加拿大的研究顯示，在魁北克出生男嬰的X 連鎖CNDI 發(fā)病率約為8.8/100萬，約50%的AVPR2基因突變患者家系中可發(fā)現(xiàn)女性攜帶者，而其余患者為新發(fā)突變［4］。AVPR2基因位于染色體Xq28 區(qū)，由3 個內(nèi)含子和2個外顯子組成，編碼1 個含有371 個氨基酸的蛋白，為G 蛋白偶聯(lián)受體。生理狀態(tài)下，AVP 與位于腎集合管基底膜主細胞上的AVPR2受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶（cyclic adenosine monophosphate，CAMP）產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，從而激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），使細胞內(nèi)的AQP2磷酸化，易位到主細胞膜頂膜，發(fā)揮水的重吸收作用，實現(xiàn)尿液濃縮［5］。當AVPR2或AQP2基因位點突變造成遠端腎單位對AVP 的抗利尿激素作用不敏感或無反應(yīng)，導(dǎo)致尿液濃縮功能障礙，從而發(fā)生CNDI。

AVPR2基因突變導(dǎo)致X連鎖CNDI，臨床上男性患者常見，而雜合子女性患者由于X 染色體的失活偏倚出現(xiàn)不同的臨床表型，臨床表現(xiàn)多樣，多飲、多尿的程度可有明顯不同［1］。AVPR2基因突變導(dǎo)致的X 連鎖CNDI 的位點在逐漸增加，目前共發(fā)現(xiàn)280 多種AVPR2基因突變，以錯義突變?yōu)橹鳎?］，中國目前已發(fā)現(xiàn)32個AVPR2突變位點，錯義突變占29個［2］。根據(jù)基因序列分析及亞細胞分類將AVPR2基因突變分為5 類：第1 類突變干擾了mRNA 正確的轉(zhuǎn)錄、加工與翻譯，產(chǎn)生了截短蛋白質(zhì)，這些蛋白通常被迅速降解；第2 類突變最為常見，AVPAR2基因的錯義突變或插入、缺失產(chǎn)生了全長蛋白，使蛋白錯誤折疊，雖然保持了內(nèi)在的功能，但由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)控機制與蛋白酶體降解的靶向性，使錯誤折疊蛋白被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，不能在細胞膜表面正常表達；第3類突變導(dǎo)致了血漿中膜表達受體與Gs 蛋白結(jié)合能力的下降，從而導(dǎo)致磷酸化途徑激活減弱，影響與Gs 蛋白的耦聯(lián)；第4類突變導(dǎo)致對抗利尿激素親和力降低，突變雖然沒有影響AVPR2在細胞膜上的正常表達，但是與AVP 結(jié)合能力下降；第5 類突變被誤傳到不同亞細胞器中，突變基因可能編碼合成正常的受體蛋白，但在細胞內(nèi)錯誤定位，不能在細胞膜上正常表達［6-7］。此外，AVPR2突變也會發(fā)生“功能增益”，這些突變受體過度增加了對AVP 的親和力，導(dǎo)致腎源性的抗利尿激素不適當分泌［8］。

CNDI 多于嬰幼兒期發(fā)病，若飲水充分，患兒一般狀況可正常，無明顯體征，或僅有發(fā)熱、易激惹、便秘、嘔吐、生長障礙等非特異表現(xiàn)，臨床醫(yī)師認識不足易誤診、漏診，耽誤最佳的治療時機，嚴重可致智力障礙、生長發(fā)育遲緩、腎積水、腎功能不全、嚴重的電解質(zhì)紊亂導(dǎo)致死亡。禁水試驗可初步判定患者是否為尿崩癥，禁水-加壓素試驗可以進一步區(qū)分神經(jīng)性尿崩癥和腎性尿崩癥，即給予外源性AVP 或去氨加壓素后，尿滲透壓變化不明顯或升高不超過50%，診斷為腎性尿崩癥［9］。CNDI 在腎性尿崩癥中僅占約10%，應(yīng)慎重排除繼發(fā)性腎性尿崩癥。然而，有報道稱少數(shù)CNDI 患者在禁水試驗或外源性注射AVP后，尿液濃縮能力明顯增加［10］，臨床稱為不完全型CNDI。這種殘存的尿濃縮能力可能是為了防止嚴重高滲脫水的發(fā)生。迄今，所有已證實為AVPR2基因錯義突變患者中，有17 例不完全型X-CNDI表型［10-11］。

兒童行禁水-加壓素試驗應(yīng)密切監(jiān)測生命體征，以防出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)紊亂、休克、驚厥等并發(fā)癥。通常禁水6 h已足夠，體質(zhì)量下降超過5%則需終止試驗。禁水后尿滲透壓達不到血滲透壓的2.5 倍以上，而血滲透壓增高＞305 mOsm/kg 可終止試驗，診斷為尿崩癥，其中尿滲透壓＜血滲透壓者為完全性尿崩癥，尿滲透壓＞血滲透壓者為部分性尿崩癥。小嬰兒若血尿滲透壓留取困難或醫(yī)療條件有限，可用尿比重計，禁水后每小時測尿比重，同時留尿常規(guī)，若尿比重進行性增高，繼續(xù)留尿，若兩次尿比重之差＜0.001，停止禁水試驗，行加壓素試驗，皮下注射垂體后葉素（0.1～0.2 IU/kg或5 IU/m2），重復(fù)上述操作，持續(xù)留尿至兩次尿比重之差＜0.001支持腎性尿崩癥，或尿比重達1.015 以上提示垂體性尿崩癥。正常的垂體后葉呈現(xiàn)高信號是由于垂體后葉內(nèi)有含抗利尿激素的神經(jīng)分泌顆粒，一般認為垂體后葉T1W1 信號強弱與后葉血管加壓素含量密切相關(guān)，本例患兒基因結(jié)果未回報前，垂體核磁短期內(nèi)出現(xiàn)T1W1 信號由正常變?yōu)橄ВR床考慮是否為中樞性尿崩癥，而禁水-加壓素試驗支持腎性尿崩癥，給臨床診療造成了很大困擾，也曾試用AVP 治療，患兒癥狀無改善，換用氫氯噻嗪及阿米洛利治療，患兒癥狀明顯改善，基因結(jié)果也支持腎性尿崩癥的診斷。該患兒的垂體T1信號消失分析原因可能是與患兒病史較長，持續(xù)脫水未能完全糾正有關(guān)，導(dǎo)致垂體后葉AVP 含量減少有關(guān)，垂體后葉AVP 含量降低，垂體核磁T1加權(quán)像也會呈現(xiàn)高信號缺乏。

由于該癥較少見且存在異質(zhì)性，當出現(xiàn)不完全型CNDI 或因失活偏倚導(dǎo)致臨床癥狀輕微甚至無癥狀的X連鎖CNDI的雜合子女性患者，通過傳統(tǒng)的方法進行鑒別診斷較為困難。這時基因診斷顯得尤為重要，通過檢測AVPR2和AQP2不僅可以早期明確診斷，使患者得到及時治療，防止出現(xiàn)智力障礙、發(fā)育落后等嚴重并發(fā)癥，并為家族性病例提供遺傳學幫助，以及為突變基因攜帶的成年女性提供產(chǎn)前篩查。

CNDI 治療現(xiàn)狀主要是對癥治療而非針對病因治療。對癥治療的目的是補液同時聯(lián)合低鹽低蛋白飲食，防止脫水。藥物治療常用利尿劑和非甾體抗炎藥。氫氯噻嗪通過抑制遠曲小管對Na的重吸收，使尿量減少。近期研究發(fā)現(xiàn)，氫氯噻嗪可減少鋰誘導(dǎo)腎性尿崩癥小鼠近端小管對Na的重吸收，減少尿量，同時氫氯噻嗪可以促進AQP2 在小鼠集合管上皮細胞的表達［12］。但長期單一用藥效果不佳，目前不作為首選［13］。氫氯噻嗪［2～4 mg/（kg·24 h）］聯(lián)合阿米洛利［0.3 mg/（kg·24 h）］，能使患者尿量降低50%，耐受性較好，減少低鉀血癥的發(fā)生，是目前推薦的臨床一線用藥［14］。

隨著CNDI 分子生物學的發(fā)展以及發(fā)病機制的闡明，目前產(chǎn)生了很多針對病因的新型治療手段，根據(jù)CNDI 的類型不同，治療的靶點和策略也有所不同，針對CNDI的病因治療研究目前主要集中于3方面：（1）修復(fù)錯誤折疊蛋白，使其恢復(fù)正常的蛋白結(jié)構(gòu)并從滯留的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脫離，進而正確定位到細胞膜表面［6］。（2）直接作用于滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊的受體蛋白發(fā)揮作用［6］。（3）不通過AVPR2介導(dǎo)，直接激活A(yù)QP2［3］。但應(yīng)用于臨床的安全性和有效性尚需進一步評估。