高效液相色譜法測定蔬菜中硝基苯

(1.榆林職業技術學院 化學工程系， 榆林 719000；2.榆林學院 信息工程學院，榆林 719000)

1 實驗部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀：由RO230溶劑管理器、DAD230+二極管陣列檢測器、ZW230II色譜柱溫箱、P230高壓恒流泵組成(大連依利特儀器有限責任公司生產)；高速組織搗碎機(德國IKA公司)；H1750臺式高速離心機(長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 試劑

硝基苯母液：濃度1000mg/L，購自國家標準物質中心。

硝基苯標準使用液：取硝基苯母液若干稀釋配制，濃度分別為0.25mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L。

甲醇： HPLC Grade，Honeywell Burdick&Jackson公司生產；乙腈：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；四氫呋喃;色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；正己烷：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；無水硫酸鈉 ： 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；丙酮：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；硫酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產；高純水(自制，二次蒸餾水經0.25um水相濾膜過濾后使用)。

1.3 樣品前處理

把蔬菜(以茼蒿、萵苣、胡蘿卜為樣品)切成 1～ 2cm的段狀，準確稱取約200g樣品，加入100mL 10%硫酸溶液(密度1.07g/mL)，樣品加硫酸溶液總重307克，用組織搗碎機搗碎至勻漿，制備成均勻樣品，稱取上述勻漿樣品15.35克(相當于10.0 g樣品的量)，置于100 mL塑料離心管中，加入40 mL丙酮-正己烷(1:9，v/v)，于均質機上高速均質3 min，3800 r/min離心5 min，提取液移入250 ml分液漏斗中，加入100 mL20 g/L硫酸鈉水溶液，于分液漏斗振蕩器上160 rpm/min振蕩2 min，靜置分層，將下層溶液轉移到另一250 mL分液漏斗中，用20 mL正己烷萃取，合并兩次正己烷萃取液，用無水硫酸鈉脫水(或轉入K-D濃縮器中濃縮并定容)備色譜分析用。

2 實驗條件優化

2.1 色譜柱的選擇

比較了5種不同型號的反相色譜柱對硝基苯的分離效果：

Diamonsil C18色譜柱(5μm，4.6mm×150mm)；Asahipak色譜柱(5μm，4.0mm×250mm)；nucleodurC18ec色譜柱(5μm，4.6mm×150mm)；Waters biosuite色譜柱(5μm，4．6mm×35mm)；

SinochromODS-BP色譜柱(5μm，4.6mm×200mm)。

結果表明，硝基苯通過SinochromODS-BP色譜柱(5 μm，4.6mm×200 mm) 色譜柱峰形最好，與其他可能的干擾物質分離效果最好，可以充分滿足測定要求。因此，選擇SinochromODS-BP色譜柱作為分析柱。

2.2 流動相選擇

通過比較四氫呋喃-水、乙腈-水，甲醇-水這3種混合流動相體系，發現甲醇-水混合流動相體系能夠很好的分離硝基苯，峰形良好，不會出現峰拖尾，鬼峰，平頭峰，以及其他不完全出峰的情況，出峰結果見圖1、圖2、圖3。

圖1 0.5mg/L 硝基苯標準溶液色譜圖四氫呋喃-水體系 v/v=10∶90，流速1mL/min-1

圖2 0.5mg/L 硝基苯標準溶液色譜圖乙腈-水體系 v/v=60∶40，流速1mL/min-1

圖3 0.5mg/L硝基苯標準溶液色譜圖甲醇-水體系 V/V=85∶15，流速1mL/min-1

甲醇和水的比例不同，可以導致出峰時間不同，峰形不同，以及分離度的差異，經過不同的體積比選擇，本方法選擇甲醇∶水v/v=85∶15，硝基苯出峰時間為3.516min。

2.3 檢測波長的選擇

對硝基苯標準溶液進行紫外-可見光全波長掃描分析，在264 nm 波長附近有最大吸收，過低的吸收波長基線噪音大，容易造成干擾，過高的吸收波長例如350 nm 波長之后基本上無吸收，綜合考慮硝基苯的紫外光譜特性，最后選擇264 nm 作為定值波長;，并利用硝基苯的保留時間和紫外光譜特性進行定性分析。

2.4 方法的精密度、線性關系和檢出限

分別取硝基苯標準儲備液若干體積稀釋到 0.25、0.5、0.75 、1.0、2.0mg/L作為硝基苯的測定使用液，然后每一個濃度測定6次，實驗結果見表1、表2。

表1 0.75mg/L 硝基苯溶液保留時間測定數據 min

表2 不同濃度硝基苯溶液峰面積測定及回收率實驗 mg/L

根據不同濃度硝基苯對應的峰面積值，可以求得線性回歸方程為A=81.115C-0.1193，線性相關系數值為0.9998，以3倍信噪比(S/N)計算硝基苯的檢出限為0.1mg/kg

由實驗數據可以得到峰面積測定RSD在1.06%～4.97%之間，加標回收率在99.5%～101.9%之間，0.75 mg/L硝基苯使用液保留時間數據RSD等于0.93%，以3倍信噪比(S/N)計算硝基苯的檢出限為0.1mg/kg由此可見方法的精密度和準確度良好，靈敏度高。

2.5 實際樣品測定

對隨機購自農貿市場的茼蒿、萵苣和胡蘿卜共 10 份樣品，進行前處理及測定，樣品未檢出含有硝基苯。檢測結果表明，市售蘆筍、萵苣和胡蘿卜沒有受硝基苯的污染。

3 結論

本實驗選用反相高效液相色譜分析蔬菜中硝基苯，在采用均質、高速離心提取、萃取前處理后，甲醇/水作為混合流動相的條件下，可以得到良好的分離效果。該方法精密度好，準確度高，檢出限低，線性關系良好，具備良好的應用前景。