對骨康靈液治療骨折病人修復(fù)機制的研究

王瓊仙,王金偉，曾躍勤,楊騏睿,韓婭南，陸發(fā)新，楊桂梅△,李成△

（1昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，云南 昆明；2云南省骨科專科醫(yī)院，云南 昆明；3昆明醫(yī)科大學(xué)分子院，云南 昆明；4昆明醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院，云南 昆明；5昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南 昆明 ）

0 引言

骨康靈液是由昆明醫(yī)學(xué)院科研中試中心經(jīng)云南省藥監(jiān)局批準生產(chǎn)滇藥制字(Z)20092434A的院內(nèi)制劑。骨折后，機體需要一個較長的時間去進行修復(fù)，以實現(xiàn)骨折愈合[1]，而受到多種原因的影響，會有骨折延遲愈合或是不愈合的情況發(fā)生[2]。骨康靈液為外用藥液，成分包含桃仁、續(xù)斷、三七、紅花等10余味中藥[3]，有其獨特的配方以及工藝流程方，對藥材炮炙加工之后將藥物粉碎，過120目篩，之后使用70%-95%酒精對藥物進行浸泡過濾，將有效成分提取出來并制備成藥液。該藥物的制備方法集傳統(tǒng)和現(xiàn)代為一體，為現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，其主要作用是接骨生新，促進骨折端的骨痂生長，加速骨折愈合，并且能夠活血化瘀，消腫止痛，舒筋壯骨，清心安神等，在跌打損傷、外傷閉合性骨折、關(guān)節(jié)紅腫痛等方面的治療效果較好。骨折愈合是一個很復(fù)雜的問題，受多種因素的影響[4]。院內(nèi)制劑是醫(yī)院藥學(xué)的重要組成部分，在我國制藥業(yè)的不斷發(fā)展創(chuàng)新之下，對院內(nèi)制劑造成較大沖擊[5]。但是對于市面上沒有的一些院內(nèi)中藥制劑，其作用不可替代，具有療效確切、安全可靠和經(jīng)濟實惠的特點，符合我國目前的國情。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為高度特異性的促進血管內(nèi)皮細胞生長的因子，其能夠增加血管通透性，促進血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成；另外，還能夠在骨-軟骨細胞的分化過程中起到相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，使骨的修復(fù)進程加快。要想實現(xiàn)骨折修復(fù)，需要大量新生毛細血管參與作用，而血管生成需要在VEGF導(dǎo)致血管通透性增加的前提下進行。在血管生成這一過程中，VEGF起到主導(dǎo)作用，其和血管內(nèi)皮細胞上的特異性受體相結(jié)合，從而對血管內(nèi)皮細胞的增殖和血管生產(chǎn)起到積極的促進作用，以此使骨折部位血管網(wǎng)得以建立，使骨折部位恢復(fù)血供，促進骨愈合。

骨折需要在膜內(nèi)骨化與軟骨化的過程中完成修復(fù)，而骨性骨痂與軟骨骨痂的組成成分為小梁骨細胞和軟骨細胞。本研究結(jié)果顯示，骨折造模成功后第7d內(nèi)，相比于成骨骨細胞、軟骨細胞中VEGF在健側(cè)肢體的表達水平，骨折側(cè)均更高，表明在骨折愈合的整個過程中，VEGF表達持續(xù)發(fā)揮作用。中醫(yī)學(xué)中，認為骨折發(fā)生后，導(dǎo)致局部氣血瘀滯，進而影響全身血液運行，導(dǎo)致瘀阻不通，形成血瘀證。而骨康靈液的功效主要為活血化瘀、消腫止痛，并且能夠促進骨痂生長，加速骨折愈合。本研究將大鼠作為實驗動物建立骨折模型，發(fā)現(xiàn)對骨折大鼠使用骨康靈液后，骨痂內(nèi)的VEGF表達顯著升高，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)明顯增殖，使血管加速生成，且骨-軟骨細胞的分化速度加快，因此對于骨折部位的修復(fù)有顯著的促進效果。

基于對文獻的復(fù)習(xí)基礎(chǔ)上，我們利用骨康靈液治療閉合性骨折的實驗性臨床研究，同時尋找骨康靈液發(fā)揮作用是與骨痂生長和VEGF的表達變化相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年10月至2018年10月在云南省骨科專科醫(yī)院收集到不同類型的外傷性閉合骨折患者900例，分別進行診治，觀察不同治療方案下的臨床療效。其中699例患者納入治療組，治療方案為小夾板固定結(jié)固定，在此基礎(chǔ)上外用骨康靈液，201例納入對照組，采取常規(guī)西醫(yī)石膏固定的治療方案。兩組患者的骨折程度比較均衡，并根據(jù)患者自身骨折狀況確定治療時間。

1.2 藥品

骨康靈液100ml/瓶，由昆明醫(yī)科大學(xué)提供。使用醫(yī)院云南省骨科專科醫(yī)院。該醫(yī)院具有專業(yè)的臨床醫(yī)生，且放射科X線攝片機等檢查設(shè)備完善。

1.3 治療方法

治療組：X線攝片確診→進行骨折復(fù)位→采取小夾板固定結(jié)方法進行固定，外用骨康靈液→進行復(fù)查→再次進行X線攝片。

對照組：X線確診→復(fù)位（方法同上）→采取常規(guī)石膏固定→復(fù)查→再次X線攝片。

在進行治療之前，需要通過X線攝片診斷患者的骨折情況，確定外傷閉合性骨折的類型，采取常規(guī)外科手法對骨折進行復(fù)位，之后進行如下治療：（1）治療組：使用薄藥棉或紗布將患者的骨折部位包纏好，采取小夾板固定結(jié)固定，然后在包纏患處的藥棉或紗布上浸入骨康靈液，4次/d，保持藥棉濕潤，使毛孔保持擴張狀態(tài)，從而促進患處吸收藥物，提升藥效。（2）對照組：使用石膏進行骨折部位的固定。兩組患者治療后定期回院復(fù)查，10-15d/次或是聽從醫(yī)囑上告知的時間，然后再次復(fù)查骨折部位的X線片，將其作為參考依據(jù)，對臨床療效、骨折愈合時間進行判斷。

1.4 閉合性骨折動物模型建立、骨康靈液藥效評價及潛在機制研究

1.4.1 動物的分組（animal and grouping)

選擇成年SD大鼠，雌性大鼠和雄性大鼠各100只，共計200只，體重平均值為（200±20）g，隨機將其分成如下4個小組：空白對照組（即假手術(shù)組）以各組大鼠的左側(cè)為研究對象，骨折組和對照組(骨折+佐劑即95%酒精組)分別入選66只大鼠，并以其右側(cè)作為研究對象，另外68只大鼠的右側(cè)納入到治療組(骨折+骨康靈液組)。每組中有幾只備用動物。實驗動物的購入來源為昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，質(zhì)量合格證號為SYSK(滇)2005-0004，許可證號為SCXK(滇)2011-0004。

1.4.2 大鼠動物模型建立（animal model)與藥物治療

制備骨折模型：對入選的200只大鼠右側(cè)股骨逆行穿克氏針進行固定之后，使用造模支架制造股骨中段骨折，并按照1.4.1中的動物分組方法實施分組，分別拍攝X線片進行觀察。將模型大鼠傷口進行縫合之后，給予肌肉注射青霉素以預(yù)防感染，劑量為15萬單位/（kg·d），共使用3d。

1.4.3 分組及給藥

骨折造模成功后按照1.4.1中的動物分組方法隨機分為4個組別，分別為空白對照組（假手術(shù)組）、骨折組、對照組、治療組。其中治療組使用骨康靈液，在患處包纏薄藥棉或紗布[6]，之后實施小夾板固定結(jié)固定，并在患處藥棉上浸入骨康靈液，4次/d，保持藥棉濕潤，這樣有利于患處皮膚毛孔開放，從而加速藥物的吸收；對照組實驗動物使用小夾板固定后常規(guī)用95%酒精治療，骨折組、空白對照組不進行藥物治療。按照常規(guī)喂養(yǎng)方法進行所有實驗動物的喂養(yǎng)。

1.4.4 X線攝片觀察骨痂生長及骨折愈合情況

在骨折造模成功并給予相應(yīng)治療的第7d、第14d、第21d、第30d、第42d、第50d分別隨機從每組中抽取大鼠各10只，對其進行腹腔麻醉，然后拍攝X線片，進行骨痂生長、骨折愈合情況的觀察，并進行評分。

1.4.5 評分標準

1分：骨折斷端邊緣趨向模糊，有輕度的骨膜反應(yīng)，未見骨痂。

2分：骨折斷端邊緣模糊，有較淺的骨膜反應(yīng)，可見少量低密度骨痂，邊緣不整齊。

3分：骨折斷端邊緣趨向于消失，有較深的骨膜反應(yīng)，骨痂增多，密度增大，邊緣清晰，骨折缺損部位尚未填滿。

4分：骨折斷端邊緣消失，骨膜反應(yīng)密度與骨影十分相近，缺損部位被骨痂填滿，與骨皮質(zhì)連接，且二者密度相同。

X光攝片后，采用0.9%的生理鹽水和4%的多聚甲醛灌注固定的方式，獲取雙側(cè)股骨，將骨折部位的骨痂、周圍軟組織同時取出，另外將健側(cè)同一水平面的股骨同組織也取出來，實施組織學(xué)處理并進行觀察。

1.4.6 免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF的表達

OTC包埋取出的組織，然后將其放在恒溫切片機中，設(shè)定為-20℃進行速凍，10 min后對組織實施切片處理，厚度為5-10μm，將切片后的組織展平，將其貼片在多聚賴氨酸或APS包被的玻璃片上，使用鉛筆對切片做好標記，以備后續(xù)貼片染色，漂片置PBS燒杯備用。將貼片放在濕盒里面，使用移液槍吸取0.01mol/L PBS溶液，然后用組化反應(yīng)板漂洗切片，每次漂洗5min，共計3次[5]。之后在37℃的條件下用5%羊血清進行孵育，時間為30min，使非特異性位點得以封閉。用一抗孵育（兔屬性，1:100），4℃條件下過夜。需進行酶組化染色時，將酶標二抗加入，37℃條件下2h。PBS洗5min，共3次。之后將DAB底物加入，H2O2標色反應(yīng)顯色。常規(guī)梯度酒精脫水，中性樹膠材片，使用光學(xué)顯微鏡進行觀察并實施拍照。若為熒光，則用二抗孵育（Alexa 549，中杉金橋，羊抗兔，1:200；Alexa 488，Invitrogen，羊抗鼠，1:100），37℃條件下進行孵育，時間為1-2h，注意避光。空白對照使用2%羊血清代替一抗。漂洗使用0.01mol/L PBS溶液，每次5min，共漂洗3次，注意進行避光處理。之后使用DAPI復(fù)染細胞核，并在熒光顯微鏡下進行陽性反應(yīng)部位的仔細觀察[6]。通過免疫組織化學(xué)法進行組織中VEGF表達水平的檢測，將每張切片通過鏡下觀察得到的陽性細胞數(shù)進行記錄。若陽性細胞胞漿染色結(jié)果為棕色，高倍視野下進行染色陽性細胞計數(shù)，并對陽性率進行計數(shù)。

1.4.7 免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF的表達影響

（1）鏡下記錄每張切片的陽性細胞數(shù)。

（2）計數(shù)高倍視野內(nèi)染色陽性細胞、計數(shù)陽性細胞率。

（3）確定骨康靈液在骨折愈合中對VEGF表達影響的機制研究。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS軟件作為本次研究各項結(jié)果數(shù)據(jù)的處理工具，其中計量資料以±s）的形式呈現(xiàn)，實施t檢驗，計數(shù)資料則開展χ2檢驗，等級資料用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

2.1.1 療效標準

（1）痊愈：骨折部位完全消腫，局部壓痛、縱向叩擊痛等完全消失，X線片顯示骨折斷端有豐富良好的骨痂生長，血腫機化被完全吸收，實現(xiàn)臨床骨折完全愈合，功能完全正常。

（2）顯效：骨折部位發(fā)紅、腫脹、疼痛等不良癥狀消失，X線片顯示骨折斷端的骨痂生長情況較好，血腫機化吸收不完全，功能可有輕微影響，但基本正常。

（3）有效：臨床癥狀、體征有所改善，但未完全消失，X線片顯示骨痂生長情況尚可。

（4）無效：癥狀、體征無明顯緩解，X線片顯示骨痂生長狀況不理想。

2.1.2 骨折愈合標準

骨折部位無痛感，如壓痛、縱向叩擊痛等均消失；活動完全恢復(fù)正常；X線攝片顯示骨痂連續(xù)性生長并通過骨折線，骨折線模糊或消失；將外固定拆除之后，進行連續(xù)2周的觀察，骨折部位未發(fā)生變形。

2.1.3 兩組療效比較

2.1.3.1 不同性別骨折部位比較

全部資料不同性別的骨折部位比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.444），兩組骨折部位基本相同。見表1。

表1不同性別骨折部位比較 [n(%)]

2.1.3.2 不同性別的療效比較

全部資料不同性別的骨折治療療效比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.066），兩組骨折治療效果基本相同。見表2。

表2 不同性別的療效比較 [n(%)]

2.1.3.3 治療組和對照組的性別比較

治療組和對照組不同性別分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.120），兩組性別分布基本相同。見表3。

表3 治療組和對照組的性別比較 [n(%)]

2.1.3.4 治療組和對照組骨折部位比較

治療組和對照組的骨折部位比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.093），兩組骨折部位基本相同。見表4。

表4 治療組和對照組骨折部位比較 [n(%)]

2.1.3.5 治療組和對照組的療效比較

治療組699例，痊愈561人，占80.3%，顯效45人，占6.4%，有效37例，占5.3%，無效56例，占8.0%；對照組201例，痊愈69人，占34.3%，顯效58人，占28.9%，有效18例，占9.0%，無效56例，占27.9%；治療組和對照組的骨折治療療效比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），治療組明顯更優(yōu)。分別統(tǒng)計兩組的臨床總有效率，治療組的92.0%顯著好于對照組的72.1%。治療組總有效率高于對照組(見表5)。

表5 治療組和對照組的療效比較

2.1.3.6 治療組和對照組的愈合時間比較

治療組和對照組的愈合時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），兩組骨折治療臨床愈合時間不同，治療組臨床愈合時間比對照組臨床愈合時間短（提前13d左右臨床愈合），1人提前13d左右臨床愈合，699人（699×13d/人=9087 ）就提前了9087d好轉(zhuǎn)，如果1人1天節(jié)約10元成本，699人就可以節(jié)約9萬多元的經(jīng)濟開支。見表6。

表6 治療組和對照組的愈合時間比較

表6 治療組和對照組的愈合時間比較

注： z=-12.100，P＜0.001

組別 n 愈合時間 t P治療組 699 34.20±8.60 -17.097 ＜0.001對照組 201 47.28±9.79

2.2 動物模型影像學(xué)實驗結(jié)果

在動物模型造模成功并進行用藥治療后的各個研究時點分別對實驗大鼠骨折部位進行X線攝片，觀察骨痂生長、骨折愈合情況，分別評分。使用骨康靈液的治療組評分均更優(yōu)。見表7、圖1。

2.3 動物模型VEGF實驗結(jié)果

各不同觀察時點每組大鼠的骨痂組織VEGF表達陽性細胞率結(jié)果見表8、圖2。

3 討論

3.1 臨床實驗

研究結(jié)果顯示，骨康靈液治療組和西醫(yī)常規(guī)對照組的臨床總有效率分別為92.0%、72.1%，表明使用骨康靈液進行治療，有利于骨痂生長、血腫機化吸收，從而促進骨折愈合[7]。通

圖1 各組大鼠各時間點骨痂組織造模后7-50d X 線影像評分結(jié)果柱狀圖

圖2 各組大鼠各時間點骨痂組織VEGF表達陽性細胞率柱狀圖

表7 各組大鼠各時間點骨痂組織造模后7-50d X 線影像評分結(jié)果

表7 各組大鼠各時間點骨痂組織造模后7-50d X 線影像評分結(jié)果

組別 7d 14d 21d 30d 42d 50d骨折+骨康靈液組 1.68±0.51 2.29±0.37 3.43±0.47 3.99±0.49 4.19±0.34 4.49±0.48骨折+95%酒精組 1.03±0.48 2.01±0.29 2.99±0.29 3.48±0.23 3.63±0.30 3.68±0.32骨折組 0.20±0.09 0.30±0.18 0.40±0.29 0.50±0.38 0.70±0.39 0.90±0.49對照組 0.1 0.3 0.4 0.5 0.7 0.9

表8 各組大鼠各時間點骨痂組織VEGF表達陽性細胞率

注：*表示骨折+骨康靈液組與骨折+95%酒精組數(shù)據(jù)進行對比，P＜0.05，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義

組別 7d 14d 21d 30d 42d 50d骨折+骨康靈液組 12.01±0.89* 20.10±1.28* 46.99±1.17* 41.09±0.80* 20.80±0.33* 5.49±0.32*骨折+95%酒精組 11.89±1.10 19.39±1.08 38.60±1.09 35.09±1.23 19.68±0.29 4.49±0.48骨折組 1.20±0.20 1.13±0.48 2.02±0.50 1.93±0.30 2.00±0.29 1.99±0.30對照組 0.1 0.3 0.7 0.6 0.3 0.2

過X線攝片判斷兩組患者的臨床骨折愈合時間，相比于對照組，骨康靈液組時間提前13d左右。骨康靈液使用便捷，直接作用于患處，能夠活血化瘀、消腫止痛、接骨生新，療效確切安全，并且費用低廉，它的發(fā)明是對中醫(yī)正骨科學(xué)的一大貢獻[8，9]。

3.2 動物模型影像學(xué)實驗

對造模成功并進行藥物治療后的各組大鼠分別在第7d、第14d、第21d、第30d、第42d、第50d實施X線攝片[10]。發(fā)現(xiàn)造模后第7d治療組和對照組影像學(xué)表現(xiàn)差異不明顯，治療組骨折斷端邊緣趨向性模糊，輕度骨膜反應(yīng)，未見骨痂[4]；第14d治療組的骨折斷端邊緣明顯模糊，有骨痂生長，但量較少，對照組未見骨痂，第21d，治療組骨折斷端骨密度增加，有逐漸加深的骨膜反應(yīng)，骨痂增多，骨折線可見，對照組僅發(fā)現(xiàn)少量骨痂。第30d，治療組的骨密度和骨膜反應(yīng)均有加深，骨折斷端被骨痂包繞，骨折線仍可見，對照組骨痂量增加。第42d，治療組骨折線基本消失，骨膜和骨質(zhì)的密度接近，缺損部位被骨痂填滿，骨小梁力學(xué)結(jié)構(gòu)趨向合理，對照組有較多的骨痂生長，骨折線比較清晰，骨小梁結(jié)構(gòu)雜亂。第50d時X線攝片，骨折線消失，骨膜反應(yīng)和骨影密度接近，骨痂密度同于骨皮質(zhì)，二者連接緊密，將骨缺損處填滿。結(jié)果表明，造模成功后第7d治療組和對照組的影像學(xué)表現(xiàn)無明顯差異(P＞0.05)，第50d治療組骨痂生長和骨折愈合情況顯著優(yōu)于對照組[11]。表明骨康靈液有利于促進骨痂生長，更好地修復(fù)骨折部位。

3.3 動物模型VEGF實驗

在造模成功用藥治療后各觀察時點分別處死各組中的10只大鼠，實施組織切片免疫組織化學(xué)染色[12]，進行軟骨細胞變化、骨痂中VEGF表達水平的觀察。結(jié)果：4組中VEGF表達水平開始出現(xiàn)差異的時間為第7d，第14d差異更大，差異最大時點為第21d，并在第30d、第42d、第50d逐漸縮小差異，治療組VEGF表達信號更強。結(jié)論：骨折愈合過程中軟骨及骨性骨痂中均有VEGF表達[13]，說明VEGF參與骨折愈合，骨康靈液則對VEGF的表達水平有增高作用，從而利于骨折修復(fù)。

總之，骨康靈液對外傷閉合性骨折病人的治療有較好的療效[14]，它的骨折臨床愈合治療時間比西醫(yī)常規(guī)治療時間提前愈合；骨康靈液不僅能促使骨痂生長，同時還能提高VEGF的表達，利于骨折修復(fù)。