生物分子液-液相分離的物理化學(xué)機(jī)制

張長(zhǎng)勝，來(lái)魯華

1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，物理化學(xué)研究所，分子動(dòng)態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心，北京 100871

2北京大學(xué)定量生物學(xué)中心，北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100871

1 引言

2009年Hyman、Brangwynne等人用PGL-1(Guanyl specific ribonuclease 1)等分子參與的相分離的理論解釋了線(xiàn)蟲(chóng)受精卵細(xì)胞極化和不對(duì)稱(chēng)分裂機(jī)制這個(gè)困擾該領(lǐng)域至少25年的難題1,2。該理論簡(jiǎn)單自然，實(shí)驗(yàn)證據(jù)豐富，啟發(fā)了生命科學(xué)其它領(lǐng)域的研究者認(rèn)識(shí)到相分離可能是一個(gè)普遍的生物分子組織定位、功能調(diào)控的機(jī)制。隨后細(xì)胞的相分離機(jī)制在發(fā)育1,2、環(huán)境壓力應(yīng)激3、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控4,5、DNA修復(fù)6、RNA剪接加工與轉(zhuǎn)運(yùn)7,8、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)9,10、固有免疫11、神經(jīng)信號(hào)傳遞12等大量的生命活動(dòng)過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)。生命體通過(guò)生物分子相分離產(chǎn)生具有各種功能的高度動(dòng)態(tài)的無(wú)膜細(xì)胞器的概念被廣泛接受13，相分離機(jī)制在生命活動(dòng)中至關(guān)重要的作用開(kāi)始逐漸清晰14。近幾年來(lái)對(duì)生物體系相分離的研究更是呈現(xiàn)井噴式的增長(zhǎng)(圖1展示了PUBMED文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/收錄的關(guān)于生物體系液-液相分離文獻(xiàn)在近20年中的變化情況)。

圖1 PUBMED數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的2000-2019年間液-液相分離文獻(xiàn)逐年快速增長(zhǎng)情況Fig.1 Rapid growth of literatures on liquid-liquid phase separation from 2000 to 2019 in PUBMED.

多組分體系相轉(zhuǎn)變是物理化學(xué)領(lǐng)域研究的基本問(wèn)題之一。由于生物分子序列與結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，研究生物分子的相分離機(jī)制對(duì)于物理化學(xué)學(xué)科來(lái)說(shuō)也是一個(gè)新的重要挑戰(zhàn)。需要發(fā)展新的實(shí)驗(yàn)、模擬和理論研究方法，從而深入認(rèn)識(shí)相分離的物理化學(xué)機(jī)制，包括其熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)、聚集體微觀(guān)結(jié)構(gòu)、序列與相分離條件和聚集體性質(zhì)關(guān)系、相分離的驅(qū)動(dòng)力和調(diào)控方式等。

本文將從相分離聚集體的基本性質(zhì)、相圖、微觀(guān)結(jié)構(gòu)、統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)、實(shí)驗(yàn)和分子模擬研究方法、相分離性質(zhì)與生物功能關(guān)系、調(diào)控分子設(shè)計(jì)這七個(gè)方面簡(jiǎn)介基本認(rèn)識(shí)、闡述當(dāng)前主要的研究進(jìn)展、總結(jié)梳理主要的研究結(jié)果，為進(jìn)一步的生物分子相分離物理化學(xué)機(jī)制的研究提供借鑒。

2 液-液相分離液滴基本性質(zhì)及表征方法

2.1 形貌

生物分子在體外形成的液滴一般為微米級(jí)大小，在溶液中自由狀態(tài)下呈球形，具有液-液兩相界面張力所導(dǎo)致的光滑表面。微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscopy)、寬場(chǎng)熒光顯微鏡(wide-field fluorescence microscopy)是觀(guān)察聚集體狀態(tài)的主要手段，軟X射線(xiàn)光譜15可用于研究其三維結(jié)構(gòu)。溶液中微米級(jí)的相分離液滴可以引起可見(jiàn)光的散射，散射的強(qiáng)度，即濁度(turbidity)主要跟液滴的尺寸和數(shù)量相關(guān)。通過(guò)濁度的測(cè)量可以很便捷的獲得體系相分離的臨界條件14,16。體外實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到的溶液中生長(zhǎng)的液滴一般比細(xì)胞內(nèi)的相分離液滴大10-1000倍17，Shayegan等人用凸透鏡誘導(dǎo)約束(convex lens-induced confinement)技術(shù)，模擬細(xì)胞內(nèi)的受限環(huán)境，限制體外液滴的大小，并用熒光顯微鏡觀(guān)察RNA polyU和RNA結(jié)合蛋白Dhh1形成的液滴，大小受限后液滴由布朗運(yùn)動(dòng)變?yōu)樘S式運(yùn)動(dòng)18。

2.2 融合與浸潤(rùn)

相分離過(guò)程首先是在過(guò)飽和溶液中，聚集體分子快速成核并生長(zhǎng)形成初始液滴(生長(zhǎng)growth)，液滴在溶液中自由移動(dòng)，小液滴之間逐漸碰撞凝聚融合成大液滴(粗化coarsening)，劇烈振動(dòng)下大液滴可以分裂為小液滴，與固體表面接觸有浸潤(rùn)現(xiàn)象。小液滴融合成為大液滴的速度可以用融合液滴的縱橫比的變化來(lái)粗略表征，也可以通過(guò)雙光阱光鑷(dual-trap optical tweezer)實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)液滴的控制和融合速度的測(cè)量19,20。理論上融合速率與液滴粘度和表面張力的比值呈負(fù)相關(guān)21,22。Berry等人23研究了核仁蛋白FIB在體外相分離過(guò)程中液滴生長(zhǎng)、粗化的動(dòng)力學(xué)，實(shí)現(xiàn)結(jié)果表明粗化過(guò)程中液滴的平均半徑與時(shí)間的1/3次冪成正比，他們還發(fā)現(xiàn)含RNA的液滴粗化更快，而溶解過(guò)程速度更慢。對(duì)于成分不同，不能互溶的液滴相互碰撞，依據(jù)表面張力的不同，形成分散或分層融合狀態(tài)24；當(dāng)兩液滴之間的界面張力小于它們與溶劑的界面張力時(shí)形成分層融合結(jié)構(gòu)，例如在核仁中有從內(nèi)到外FC-DFC-GC三層液態(tài)結(jié)構(gòu)25。

2.3 液滴內(nèi)分子的運(yùn)動(dòng)性

液滴內(nèi)各組分呈自由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，液滴內(nèi)外分子可動(dòng)態(tài)交換，常用熒光光漂白恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleaching)技術(shù)定量研究液滴組分的運(yùn)動(dòng)性。熒光相關(guān)光譜(Fluorescence correlation spectroscopy)技術(shù)通過(guò)定量測(cè)量液滴微區(qū)內(nèi)的熒光漲落，可獲得第二維里系數(shù)、分子擴(kuò)散系數(shù)、黏度、以及濃度等數(shù)據(jù)。Wei等人26用此技術(shù)描繪了LAF-1蛋白體系的包含高濃度分支的完整的相分離相圖，并研究了體系形成的液滴中LAF-1分子的運(yùn)動(dòng)性質(zhì)，他們發(fā)現(xiàn)LAF-1與長(zhǎng)鏈RNA分子polyrA3k共同作用產(chǎn)生的液滴中LAF-1蛋白的濃度及密度比純LAF-1液滴的值顯著降低，而液滴粘度卻顯著升高。脈沖梯度場(chǎng)核磁共振(Pulsed-field gradient NMR)也用于研究液滴內(nèi)分子的擴(kuò)散系數(shù)。Brady等人27應(yīng)用此技術(shù)測(cè)定的Ddx4在凝聚相中和溶液相中的擴(kuò)散系數(shù)分別為7.5 × 10-9和8.8 ×10-7cm2·s-1。他們對(duì)液滴中LAF-1分子主鏈15N的R2弛豫速率的測(cè)量結(jié)果是16.4 s-1，表明蛋白質(zhì)主鏈仍具有顯著的運(yùn)動(dòng)性。Reichheld等人28應(yīng)用核磁共振技術(shù)研究了彈性蛋白ELP3液滴內(nèi)分子的運(yùn)動(dòng)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，得到類(lèi)似的結(jié)果。

2.4 滲透性

非專(zhuān)一性滲透的分子通過(guò)液滴“孔隙”滲透到液滴內(nèi)部的能力跟分子大小有關(guān)，可用不同粒徑的葡聚糖(Dextran)研究液滴的滲透性26,29。如蛋白質(zhì)LAF-1液滴可以透過(guò)10kDa，直徑約3納米的葡聚糖分子26。專(zhuān)一性的滲透一般由進(jìn)入液滴的客體分子和基架分子專(zhuān)一性的相互作用介導(dǎo)。例如轉(zhuǎn)錄因子雌激素受體(ER)含有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBP)，只有當(dāng)雌激素配體結(jié)合于LBP之后，ER轉(zhuǎn)換至與相分離基架蛋白MED1 (LXXLL區(qū))結(jié)合狀態(tài)，ER才會(huì)被招募至MED1液滴中5。

3 影響生物大分子液液相分離發(fā)生的條件及相圖

3.1 分子濃度

一定條件下，當(dāng)生物分子濃度較稀時(shí)，生物分子均一地溶于溶劑中，當(dāng)超過(guò)臨界飽和濃度cS時(shí)，生物分子由于相互吸引作用而凝聚，體系發(fā)生相分離，從溶液中析出生成新的相，聚集相液滴具有濃度cD，當(dāng)生物分子濃度超過(guò)cD時(shí)，體系又變?yōu)閱我幌?。一般通過(guò)不同濃度下的觀(guān)察相分離是否發(fā)生，來(lái)確定體系的臨界飽和濃度cS，臨界飽和濃度越低說(shuō)明體系越易于發(fā)生相分離。對(duì)于兩種生物分子相互作用產(chǎn)生的相分離，一般用二維相圖研究相分離發(fā)生的濃度條件。

3.2 溫度

溫度對(duì)相分離的影響體現(xiàn)了相分離過(guò)程的熵效應(yīng)。多數(shù)的生物分子相分離過(guò)程是體系熵減少的過(guò)程所以溫度的升高不利于相分離的進(jìn)行。在溫度-濃度二維相圖上存在最高臨界共溶溫度(upper critical solution temperature)，例如靜電區(qū)塊相互作用驅(qū)動(dòng)的Ddx4蛋白27。對(duì)于相分離的溶劑熵或離子熵效應(yīng)顯著的體系，相分離使體系熵增加，溫度的升高有利于相分離的進(jìn)行，在溫度-濃度二維相圖上存在最低臨界共溶溫度(lower critical solution temperature)。例如依靠疏水作用聚集的彈性蛋白30，和依靠Lys/Gly rich區(qū)域相分離的Tau蛋白31。

3.3 離子強(qiáng)度(鹽濃度)

對(duì)于一價(jià)金屬離子(Na+，K+)，靜電作用對(duì)于多數(shù)的生物分子的相分離具有關(guān)鍵作用，提高鹽濃度減弱靜電作用，所以一般增加鹽濃度不利于相分離的發(fā)生，使臨界飽和濃度cS增加，聚集體粘度也會(huì)下降27。然而如果體系中疏水作用在蛋白分子間相互作用中起主要作用，那么增加鹽濃度將有利于該蛋白的相分離，例如RNA結(jié)合蛋白FUS的N端低復(fù)雜度(LC)結(jié)構(gòu)域32。對(duì)于二價(jià)金屬(Mg2+，Zn2+)提供多價(jià)相互作用促進(jìn)相分離的體系，其濃度超過(guò)臨界濃度時(shí)相分離才可發(fā)生11,33。

3.4 pH值

pH值影響氨基酸的質(zhì)子化狀態(tài)。增強(qiáng)分子間相互作用的pH值條件促進(jìn)相分離的發(fā)生。例如酵母細(xì)胞在受到環(huán)境壓力后細(xì)胞質(zhì)pH值下降，將促進(jìn)天然無(wú)序蛋白SUP35的相分離3。

3.5 擁擠效應(yīng)

體外實(shí)驗(yàn)中常用加入PEG(聚乙二醇)分子的方法引入擁擠效應(yīng)，以模擬細(xì)胞中的擁擠環(huán)境。擁擠效應(yīng)提高了生物分子的有效濃度，會(huì)促進(jìn)相分離的發(fā)生34。

3.6 核酸分子對(duì)蛋白質(zhì)相分離的影響

核酸分子對(duì)蛋白質(zhì)相分離的影響主要取決于核酸分子是否增強(qiáng)了體系的多價(jià)相互作用。若核酸分子與蛋白質(zhì)分子有較強(qiáng)專(zhuān)一性的多價(jià)相互作用，那么核酸分子將促進(jìn)蛋白質(zhì)相分離的發(fā)生；若核酸分子的強(qiáng)帶電性主要起到的是類(lèi)似鹽離子的靜電屏蔽作用，削弱蛋白質(zhì)之間的相互作用，那么核酸分子的加入會(huì)抑制相分離的發(fā)生；若同時(shí)存在核酸-蛋白作用和靜電屏蔽兩種效應(yīng)，但是都較弱，那么一般是在核酸濃度較低時(shí)促進(jìn)相分離，核酸濃度較高時(shí)抑制相分離，例如FUS蛋白LC結(jié)構(gòu)域32以及Banerjee等人構(gòu)建的模式體系35。Zhou實(shí)驗(yàn)室36用表面帶3個(gè)或2個(gè)相互作用區(qū)塊的小球模擬蛋白質(zhì)和核酸分子的多價(jià)和靜電作用，用Gibbs系綜蒙特卡洛模擬的方法37,38研究了核酸／蛋白質(zhì)體系在不同的蛋白質(zhì)-核酸作用強(qiáng)度下的兩相平衡(即兩相共存)濃度，得到相圖。

3.7 相分離數(shù)據(jù)庫(kù)

Zhang實(shí)驗(yàn)室建立的生物體系液-液相分離數(shù)據(jù)庫(kù)(LLPSDB)39較全面的收集了生物分子相分離發(fā)生條件的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為相分離的物理化學(xué)機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。

4 驅(qū)動(dòng)液-液相分離的生物分子結(jié)構(gòu)特征

相分離的主要驅(qū)動(dòng)因素是多價(jià)相互作用，同時(shí)液-液相分離需要結(jié)構(gòu)上保證相互作用的動(dòng)態(tài)性。本文將提供多價(jià)相互作用的結(jié)構(gòu)總結(jié)為三大類(lèi)，并提供部分實(shí)例，更多的例子可以參考近期的其他綜述文章13,40,41。

4.1 由多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域特異性作用介導(dǎo)的相分離

第一大類(lèi)是利用特異性的蛋白質(zhì)相互作用，其中重復(fù)的結(jié)構(gòu)域提供多價(jià)作用，重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間的柔性提供相互作用的動(dòng)態(tài)性。主要有兩類(lèi)體系：

(1)多個(gè)相同／相似結(jié)構(gòu)域的線(xiàn)性串聯(lián)(圖2a所示)，例如NCK等蛋白質(zhì)的SH2，SH3結(jié)構(gòu)域重復(fù)，N-WASP蛋白的PRM結(jié)構(gòu)域重復(fù)42，多泛素化43等。

圖2 相分離體系提供多價(jià)相互作用的類(lèi)型示例Fig.2 Illustration of multivalent force types in biomolecular phase separation systems.

(2)蛋白質(zhì)的寡聚(圖2b所示)，如突觸后致密物PSD中的PSD-95是底物結(jié)合誘導(dǎo)的二聚體，SynGAP蛋白通過(guò)Coiled結(jié)構(gòu)域形成三聚體44，核仁蛋白NPM1通過(guò)N端結(jié)構(gòu)域形成五聚體25等。

4.2 由蛋白質(zhì)無(wú)序區(qū)域介導(dǎo)的相分離

第二大類(lèi)是由蛋白質(zhì)天然無(wú)序區(qū)(intrinsically disordered proteins/domains)或稱(chēng)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域(low complicity domains)驅(qū)動(dòng)形成的相分離45。大量的重復(fù)結(jié)構(gòu)片段可以提供多價(jià)作用，固有的無(wú)序結(jié)構(gòu)提供相互作用的動(dòng)態(tài)性46。這類(lèi)蛋白相比于第一大類(lèi)可以提供更多價(jià)、更靈活多樣的相互作用方式，因此驅(qū)動(dòng)生物體系大多數(shù)液態(tài)聚集體形成的基架分子為這類(lèi)蛋白。有以下典型的例子：

(1)多個(gè)帶相同電荷殘基集中區(qū)域(圖2c所示)。例如在Ddx4的N端結(jié)構(gòu)域(1-236)包含多段正電荷殘基(Arg/Lys)或負(fù)電荷殘基(Glu/Asp)集中分布的區(qū)域47,48，提供多價(jià)的靜電相互作用。

(2)含多個(gè)RGG以及(G/S)Y(G/S)單元(圖2d所示)，例如FUS，LAF1等核蛋白，精氨酸的胍基與酪氨酸的芳香環(huán)有cation-π以及類(lèi)似π-π的相互作用，酪氨酸之間也可以形成π-π相互作用，精氨酸的胍基與核酸的磷酸基團(tuán)有強(qiáng)靜電作用，以及與堿基有cation-π以及類(lèi)似π-π的較強(qiáng)相互作用。Vernon等人49詳細(xì)研究了π-π或類(lèi)似π-π相互作用在蛋白質(zhì)相分離中的重要作用。Wang等人19研究了22個(gè)FUS家族的蛋白質(zhì)的低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域相分離的臨界飽和濃度，發(fā)現(xiàn)與Arg、Tyr殘基數(shù)目的乘積成反比，將FUS中的精氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸，或?qū)⒗野彼嵬蛔優(yōu)楸奖彼岫紩?huì)明顯降低蛋白的相分離能力。他們的研究也發(fā)現(xiàn)Gly對(duì)于增加液滴內(nèi)蛋白的運(yùn)動(dòng)性，維持聚集體的流動(dòng)性很重要。

(3)富含Gln/Asn序列。這是多數(shù)朊蛋白樣結(jié)構(gòu)域的特征。天冬酰胺、谷酰胺殘基側(cè)鏈之間以及側(cè)鏈與主鏈之間氫鍵50、以及其它偶極作用是這類(lèi)蛋白聚集的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力51。例如亨廷頓蛋白(HTT exon1)的聚集主要是其polyQ序列提供的多價(jià)作用驅(qū)動(dòng)的，并且其中谷酰胺(Q)的數(shù)目決定了聚集體的形態(tài)，過(guò)長(zhǎng)的polyQ序列會(huì)導(dǎo)致不可逆的纖維樣聚集體的形成，與疾病直接相關(guān)52。Fiumara等人分析了富含Gln/Asn以及polyQ序列的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，他們認(rèn)為卷曲螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于促進(jìn)這類(lèi)蛋白的聚集具有重要作用53。

(4)在彈性蛋白(Elastin)中，VPG等序列重復(fù)出現(xiàn)，其疏水作用提供相分離驅(qū)動(dòng)力30。

4.3 核酸分子介導(dǎo)的相分離

第三大類(lèi)是核酸分子(DNA或RNA)，單鏈核酸的柔性為相互作用提供動(dòng)態(tài)性。在模式體系(表1g)中的研究發(fā)現(xiàn)單鏈核酸與蛋白質(zhì)易于聚集成液滴，而雙鏈核酸較為剛性，與蛋白質(zhì)易于形成凝膠狀聚集體54。

核酸分子提供的多價(jià)作用有三種類(lèi)型。(1)核酸分子的主鏈磷酸基團(tuán)可以提供多價(jià)的靜電作用(圖2e所示)。這種多價(jià)作用類(lèi)型沒(méi)有序列特異性。(2)核酸序列的重復(fù)擴(kuò)展也為其依靠堿基對(duì)的多價(jià)性發(fā)生核酸分子自身的相分離(如表1a的(CAG)或(CUG) repeat RNA可發(fā)生不依賴(lài)蛋白質(zhì)的相分離55)。(3) RNA序列中存在重復(fù)多個(gè)特異結(jié)合某個(gè)蛋白質(zhì)的區(qū)塊，這些區(qū)塊為其與該蛋白質(zhì)的相分離提供較專(zhuān)一的多價(jià)作用(圖2f所示)。相同的蛋白質(zhì)分子與不同多價(jià)結(jié)構(gòu)的RNA分子相分離，會(huì)導(dǎo)致形成不同性質(zhì)、不同功能的聚集體。Longdon等人的研究發(fā)現(xiàn)33,56，在霉菌Ashbya gossypii細(xì)胞中，三種mRNA BNI1、SPA2與CLN3都與Whi3蛋白作用發(fā)生相分離，但是BNI1與SPA2的液滴可以共定位于細(xì)胞的尖端，而CLN3液滴具有更大的密度與前兩者不能融合，定位于細(xì)胞核周?chē)Ｋ麄兊难芯拷沂景l(fā)現(xiàn)這種差異性來(lái)源于BNI1/SPA2二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)中的Whi3結(jié)合位點(diǎn)的分布不同。它們的序列中都含有5個(gè)Whi3結(jié)合位點(diǎn)，但是在CLN3中位點(diǎn)間隔顯著小于BNI1/SPA2，導(dǎo)致CLN3與Whi3形成的液滴相比于BNI1/SPA2液滴具有更大的粘度，更大的密度和內(nèi)部分子更差的運(yùn)動(dòng)性56。另外CLN3二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)中與BNI1或SPA2互補(bǔ)的序列被埋藏，導(dǎo)致CLN3不能進(jìn)入BNI1/SPA2液滴，不能發(fā)生CLN3與BNI1/SPA2液滴的融合。CLN3重折疊改變二級(jí)結(jié)構(gòu)，暴露互補(bǔ)序列后就可以被BNI1/SPA2液滴招募33。

表1 研究生物分子相分離物理化學(xué)機(jī)制的模式實(shí)驗(yàn)體系Table 1 The model systems for experimental studying the physiochemical mechanisms of biomolecular phase separation.

5 影響生物大分子液液相分離發(fā)生的條件及相圖

5.1 Flory-Huggins理論

從熱力學(xué)角度看，相分離的發(fā)生降低了體系整體的自由能57。體系的自由能可分解為焓變和熵變的貢獻(xiàn)，焓變包含生物分子與溶劑之間、生物分子之間以及溶劑分子之間勢(shì)能的變化，熵變衡量體系自由度的變化。Flory58和Huggins59在上世紀(jì)40年代提出了高分子溶液的“似晶格”模型，用高分子的體積分?jǐn)?shù)φ作為參數(shù)，推導(dǎo)出了理想高分子溶液混合熵變的計(jì)算公式，以及用平均作用場(chǎng)假設(shè)，引入?yún)?shù)χ描述相互作用能的變化，得到了混合焓變的理論計(jì)算公式，混合自由能變F的計(jì)算公式即為公式(1)，

式中kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為溫度，N為高分子鏈的長(zhǎng)度，z為晶格的配位數(shù)，ups、upp、uss分別為高分子的一個(gè)鏈段與一單位溶劑之間、一對(duì)鏈段之間、一對(duì)溶劑之間的結(jié)合能。Flory和Huggins的理論以十分簡(jiǎn)潔、粗略的形式解釋了包含生物大分子在內(nèi)的高分子相分離過(guò)程的熱力學(xué)機(jī)制。

Flory和Huggins的理論中體系由于混合熵變總為負(fù)，當(dāng)χ取較大的正值時(shí)，混合自由能會(huì)取到正值，也就是體系趨向于兩相，而不是混合，這時(shí)混合自由能對(duì)濃度(體積分?jǐn)?shù))的函數(shù)存在兩個(gè)谷值點(diǎn)，即為相分離的臨界濃度值60。

5.2 其它統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)理論

在Flory和Huggins的焓變公示推導(dǎo)過(guò)程中只考慮了近程的相互作用，Overbeek和Voorn61在他們的工作基礎(chǔ)上考慮了長(zhǎng)程靜電相互作用，應(yīng)用于帶Z個(gè)正電和Z個(gè)負(fù)電而整體不帶電的聚電解質(zhì)高分子溶液。他們假設(shè)這些電荷隨機(jī)的散布于溶液中，與鹽溶液類(lèi)似可以用Debye-Hückel理論假設(shè)計(jì)算體系中的電荷間相互作用的能量。之后，隨機(jī)相位近似(random phase approximation，RPA)方法被應(yīng)用于的聚電解質(zhì)高分子溶液靜電作用的計(jì)算，該方法可用于任意電荷分布樣式的聚電解質(zhì)高分子溶液體系62,63。Lin等人48,64將該方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子相分離體系的計(jì)算，解釋了同種電荷在序列上集中分布對(duì)于相分離的驅(qū)動(dòng)作用，以及離子強(qiáng)度對(duì)于靜電作用為主的相分離體系的影響。場(chǎng)理論模擬(Field theory simulation)方法是更細(xì)致處理聚電解質(zhì)高分子溶液體系的方法，通過(guò)對(duì)場(chǎng)理論中的共軛變量進(jìn)行模擬采樣，來(lái)獲得體系的相圖。McCarty等人65用離散的鏈模型表示不同Lys/Glu肽鏈，用場(chǎng)理論模擬方法獲得了它們的鹽濃度-蛋白濃度相圖，得到跟RPA理論相近的結(jié)果。

6 研究生物分子液-液相分離物理化學(xué)機(jī)制的手段

天然發(fā)生相分離的生物大分子序列復(fù)雜導(dǎo)致其構(gòu)象復(fù)雜，分子間相互作用多樣，從實(shí)驗(yàn)上細(xì)致研究分子序列、結(jié)構(gòu)與相分離條件、聚集體性質(zhì)之間的關(guān)系比較困難。當(dāng)前的研究試圖從兩個(gè)方面解決這個(gè)問(wèn)題，一是尋找并研究簡(jiǎn)化的相分離模式實(shí)驗(yàn)體系，用簡(jiǎn)單重復(fù)序列研究電荷性質(zhì)、殘基種類(lèi)、序列長(zhǎng)度等參數(shù)對(duì)相分離的影響；另一方面是利用分子模擬的方法，利用與序列相關(guān)的力場(chǎng)勢(shì)能函數(shù)，研究預(yù)測(cè)體系相分離的性質(zhì)和規(guī)律。

6.1 利用模式體系實(shí)驗(yàn)研究生物分子相分離

表1收集了不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)/核酸相分離的模式體系研究對(duì)象及主要結(jié)果。包括單核酸(a)、柔性連接(b、c)、天然無(wú)序蛋白質(zhì)(d)、蛋白質(zhì)+核酸(e、f、g)、蛋白質(zhì)+蛋白質(zhì)(h、i)等體系。

6.2 生物分子液-液相分離過(guò)程的分子模擬

生物分子相分離是眾多分子通過(guò)隨機(jī)的多價(jià)作用形成，因此相分離的模擬體系需要包含足夠數(shù)目的分子，參與相分離的蛋白質(zhì)或核酸又往往包含幾十到幾百的殘基，因此相分離體系的模擬難以依靠原子級(jí)精細(xì)的力場(chǎng)模擬完成，一般需要粗?；哪Ｐ蛠?lái)完成。最近，Dignon等人70對(duì)天然無(wú)序蛋白質(zhì)的液-液相分離模擬方法作了簡(jiǎn)要的綜述。本文將著重介紹Mittal實(shí)驗(yàn)室71開(kāi)發(fā)的用于長(zhǎng)條形盒子動(dòng)力學(xué)模擬(Slab simulation)的蛋白質(zhì)粗粒化方法以及Pappu實(shí)驗(yàn)室72開(kāi)發(fā)的格點(diǎn)模型下模特卡羅模擬的粗?；椒?。Chan實(shí)驗(yàn)室73,74在生物分子相分離的模擬分子模擬方法方面也有較深入的研究。

6.2.1 長(zhǎng)條形盒子動(dòng)力學(xué)模擬(Slab simulation)的粗粒化方法

該模擬方法將所有分子放在長(zhǎng)條形的周期性盒子(三個(gè)方向邊長(zhǎng)：x=y＜＜z)中，在NPT系綜的隱式溶劑分子動(dòng)力學(xué)模擬中，做只沿z軸方向平衡的各向異性壓力耦合(pressure coupling)。這樣分子模擬中相分離完成后蛋白分子聚集于凝聚相，在z軸的很窄的區(qū)域分布。Mittal實(shí)驗(yàn)室71開(kāi)發(fā)了用于這一模擬的蛋白質(zhì)粗粒化方法。蛋白質(zhì)鏈的每個(gè)殘基看作一個(gè)粒子，相鄰粒子間用彈簧相連。不相鄰粒子間包含兩種作用勢(shì)函數(shù)：Debye-Hückel靜電屏蔽的靜電作用和短程的成對(duì)勢(shì)。短程的成對(duì)勢(shì)從Lenard-Jones勢(shì)改造而來(lái)，Mittal實(shí)驗(yàn)室建議了兩種模型，即基于殘基對(duì)疏水性調(diào)整LJ勢(shì)的模型(HPS模型)和Kim-Hummer發(fā)展的原用于蛋白-蛋白相互作用研究的修正LJ勢(shì)勢(shì)阱深度參數(shù)的模型(KH模型)。這兩個(gè)模型的未定參數(shù)都通過(guò)擬合天然無(wú)序蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑(來(lái)自小角X射線(xiàn)散射實(shí)驗(yàn))來(lái)得到。隨后他們用這個(gè)粗?；瘎?dòng)力學(xué)模擬方法計(jì)算了FUS和LAF-1這兩個(gè)相分離體系的溫度-濃度相圖。他們的計(jì)算表明FUS的模擬磷酸化突變使最高臨界共溶溫度降低(即不利于相分離)，將FUS序列拷貝延長(zhǎng)將增加最高臨界共溶溫度，LAF全長(zhǎng)的最高臨界共溶溫度比只有IDR時(shí)的值高。這些結(jié)果都與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。該實(shí)驗(yàn)室還用這個(gè)模型計(jì)算的臨界溫度值，同天然無(wú)序蛋白質(zhì)單分子的性質(zhì)，即天然無(wú)序線(xiàn)團(tuán)到蜷縮球轉(zhuǎn)變溫度(Tθ)高度相關(guān)，因此他們認(rèn)為天然無(wú)序蛋白自身的性質(zhì)可以用于預(yù)估其相分離發(fā)生的條件75。他們也與Fawzi實(shí)驗(yàn)室合作，用此模擬方法研究了hnRNPA2低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域的單點(diǎn)突變對(duì)其相分離條件的影響。他們發(fā)現(xiàn)D290V突變體比野生型具有更低的臨界共溶溫度，相同溫度下，此突變體的臨界濃度比野生型高8。

6.2.2 格點(diǎn)模型下蒙特卡洛模擬

Pappu實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)注于該方法的研究，他們開(kāi)發(fā)了LASSI (Lattice simulation of Sticker and Spcacer Interactions)具體實(shí)現(xiàn)了格點(diǎn)模型的聚集模擬72。格點(diǎn)模型是更為簡(jiǎn)化的模型，一般將生物分子的結(jié)構(gòu)域(功能單元)整體作為一個(gè)粒子，粒子只能處于離散立方網(wǎng)格的格點(diǎn)中，不同粒子所在格點(diǎn)不能重合，一般假設(shè)只有相鄰格點(diǎn)粒子有相互作用并且粒子對(duì)的相互作用能參數(shù)化為一個(gè)確定值，體系用蒙特卡洛方法演化采樣。Pappu實(shí)驗(yàn)室用此模擬方法研究了核仁FIB1-NPM1-RNA三元體系中結(jié)構(gòu)域相互作用模式影響形成分層液滴的機(jī)制，其中用一個(gè)分枝的結(jié)構(gòu)模擬NPM1分子五聚體的結(jié)構(gòu)25。他們也用此模擬方法做了(SH3)m+ (PRM)n體系中無(wú)序連接鏈對(duì)相分離的影響的研究76。模擬結(jié)果顯示連接鏈的有效溶劑體積影響該體系聚集態(tài)的性質(zhì)，連接鏈有效溶劑體積大、主要為較剛性的伸展構(gòu)象時(shí)體系傾向于聚集成凝膠，而相反，連接鏈以壓縮狀態(tài)為主時(shí)體系傾向于聚集成液滴。

7 液液相分離的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其在細(xì)胞中的功能

7.1 生物分子相分離的生物學(xué)功能

生物分子相分離在生命體活動(dòng)中扮演著重要而多樣的功能。表2列舉了生物分子相分離在發(fā)育(a、b)、神經(jīng)活動(dòng)(c、d)、固有免疫(e)、環(huán)境壓力應(yīng)激(f、g)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控和DNA修復(fù)(h、i)、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控(j、k、l)、RNA剪接加工與轉(zhuǎn)運(yùn)(m、n、o)、核糖體合成(p)、細(xì)胞分裂(q、r)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(s、t)、蛋白質(zhì)自噬降解(u)、細(xì)胞膜內(nèi)吞(v)等細(xì)胞活動(dòng)的各方面所起的關(guān)鍵作用。相分離的這些生物功能可以總結(jié)為以下主要的五個(gè)方面，對(duì)生物分子相分離生物功能的其它分類(lèi)方式可見(jiàn)綜述14,24,77。

(1)富集。將同種功能分子富集在一起以提高局部濃度，或是將不同種類(lèi)的分子富集在一起來(lái)完成同一件任務(wù)，是生物分子相分離的首要功能。通過(guò)提高酶及其反應(yīng)底物的濃度，可以顯著提高的催化效率。Strulson等人78發(fā)現(xiàn)不依賴(lài)蛋白的RNA相分離聚集體中的核酶(Ribozyme)，HHL和HHS，催化裂解反應(yīng)的效率比溶液狀態(tài)下增加了近70倍。DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控93、RNA剪接加工7、核糖體合成(核仁中)25等過(guò)程需要眾多分子組件組裝成分子大機(jī)器才可以完成，相分離形成的液滴富集、組裝、修飾加工這些分子組件，為分子大機(jī)器提供了工作場(chǎng)所。另外液態(tài)聚集體提供了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中需要的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)足夠的穩(wěn)定性，使信號(hào)輸出需要的相互作用維持足夠的時(shí)間，來(lái)達(dá)到對(duì)輸入信號(hào)放大輸出的作用。在Nephrin +Nck + N-WASP相分離激發(fā)肌動(dòng)蛋白組裝的研究中，發(fā)現(xiàn)變化Nck/Nephrin的比例，將改變N-WASP穩(wěn)定停留的時(shí)間，進(jìn)而影響信號(hào)輸出，即肌動(dòng)蛋白的組裝79。

(2)屏蔽。在細(xì)胞受到環(huán)境壓力時(shí)，為避免細(xì)胞內(nèi)重要生物分子受到破壞損傷，這些分子通過(guò)躲避至這些臨時(shí)的聚集體中，同時(shí)一般抑制其自身活性，等到壓力解除后重新恢復(fù)3,80。mRNA通過(guò)相分離液滴載運(yùn)過(guò)程中mRNA的翻譯暫時(shí)被沉默，也是屏蔽保護(hù)的功能8。DNA損傷后，損傷部位的相分離對(duì)受損DNA也起到屏蔽保護(hù)作用6,81。HP1α相分離形成的液態(tài)聚集體專(zhuān)一性的招募異染色質(zhì)，屏蔽RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)，沉默異染色質(zhì)的基因表達(dá)92。

(3)開(kāi)關(guān)。細(xì)胞需要迅速對(duì)外界信號(hào)做出反應(yīng)，在不同狀態(tài)間進(jìn)行切換。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)10、增強(qiáng)子基因轉(zhuǎn)錄4,5、神經(jīng)細(xì)胞突觸的興奮信號(hào)傳遞12都是需要一個(gè)判斷輸入信號(hào)，達(dá)到閾值后快速高強(qiáng)度激活的過(guò)程。相分離的協(xié)同和高度動(dòng)態(tài)的性質(zhì)保證了這些生物開(kāi)關(guān)的實(shí)現(xiàn)。Hnisz等人82對(duì)增強(qiáng)子體系的相分離過(guò)程的模型研究表明參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白的數(shù)目決定著基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程的希爾系數(shù)，增強(qiáng)子體系通過(guò)相分離增加了希爾系數(shù)，也就是狀態(tài)轉(zhuǎn)變的協(xié)同性。

(4)定位。液滴通過(guò)招募錨定在特定細(xì)胞位置的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)液滴的定位，從而實(shí)現(xiàn)液滴成d分在細(xì)胞內(nèi)的精確定位。P granule向細(xì)胞極性一端遷移，使得生殖細(xì)胞所需的RNA和蛋白質(zhì)向極性一端富集定位2。T細(xì)胞信號(hào)通路的激活引發(fā)下游蛋白向細(xì)胞膜的胞內(nèi)一側(cè)富集定位10。

(5)生力。液滴將表面張力轉(zhuǎn)化為機(jī)械力的功能。例如由常染色質(zhì)的低密度區(qū)液滴的表面張力轉(zhuǎn)化的機(jī)械力改變了染色質(zhì)的三維組織結(jié)構(gòu)和應(yīng)力91。細(xì)胞膜胞內(nèi)一側(cè)的液滴表面張力轉(zhuǎn)化的機(jī)械力為細(xì)胞膜內(nèi)吞提供動(dòng)力99。

認(rèn)識(shí)生命體中某一特定體系的相分離過(guò)程一般需要如表2所示研究三類(lèi)相關(guān)的分子。首先是確定推動(dòng)相分離發(fā)生的關(guān)鍵成分分子，這些分子的凝聚為招募功能分子搭起基架，稱(chēng)為基架分子(scaffold)；然后是被招募的完成生物功能的功能客體分子(client)；第三是聚集體的生成和消失受哪些分子調(diào)控，一般是執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后修飾的分子。

表2 細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中生物分子相分離的重要作用與機(jī)制Table 2 Important cases of biomolecular phase separation in cell activities.

continued Table 2

7.2 生物分子相分離的物理化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)功能的關(guān)系

圖3列舉了相分離生物學(xué)功能所依賴(lài)的物理化學(xué)性質(zhì)。(1)聚集體對(duì)酶/底物分子的的專(zhuān)一性招募富集，顯著提高了局部聚集體對(duì)酶/底物分子的濃度，提升了催化效率。(2)若已經(jīng)定位的蛋白質(zhì)可以被液滴招募，那么整個(gè)液滴由該蛋白的所在位置而定位。(3)多組分的生物分子在同一時(shí)空聚集，同時(shí)聚集體是高度動(dòng)態(tài)可逆的，這保證了這些組分完成功能的協(xié)同性，起到生物開(kāi)關(guān)的功能。(4)液滴對(duì)小分子量分子可以滲透，對(duì)非專(zhuān)一性的大分子不可滲透，達(dá)到了對(duì)液滴外分子屏蔽，對(duì)液滴內(nèi)分子保護(hù)的功能。(5)液滴提供擁擠的環(huán)境，高粘度低擴(kuò)散系數(shù)穩(wěn)定了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)相互作用。液-液相分離聚集體所提供的擁擠環(huán)境在有些體系中會(huì)對(duì)酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響，從而影響酶的活性，在cGAS聚集體中cGAS被激活；而在進(jìn)入應(yīng)激顆粒(stress granules)中mTORC1的活性被抑制。(6)靜電作用是多數(shù)細(xì)胞內(nèi)液液相分離發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力，因此改變帶電狀態(tài)的翻譯后修飾可以靈活高效地調(diào)控相分離的發(fā)生，這一特點(diǎn)將在下一節(jié)中更詳細(xì)闡述。(7)液滴表面張力驅(qū)動(dòng)機(jī)械力的產(chǎn)生。

8 生物分子相分離的調(diào)控機(jī)制和調(diào)控分子設(shè)計(jì)

圖3 生物分子液液相分離的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著各種重要的生物學(xué)功能Fig.3 The physicochemical properties of biomolecular liquid-liquid phase separation determine that they play various important biological functions in cells.

8.1 生物分子相分離的體內(nèi)調(diào)控機(jī)制

生命體體內(nèi)的生物分子相分離過(guò)程受到精細(xì)的調(diào)控，以適應(yīng)環(huán)境改變、生命活動(dòng)周期性的變化。體內(nèi)相分離過(guò)程的調(diào)控主要包括以下幾種可能方式：

(1)通過(guò)翻譯后修飾改變參與相分離的生物分子的帶電性質(zhì)。最主要的是通過(guò)激酶催化的絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸的磷酸化，及磷酸酶催化的去磷酸化改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，調(diào)控其聚集或溶解。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs)將一個(gè)或多個(gè)S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)上的甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸的胍基上，如PRMT調(diào)控hnRNPA2或Ddx4的RGG結(jié)構(gòu)域的精氨酸甲基化，實(shí)驗(yàn)表明不對(duì)稱(chēng)的甲基化顯著削弱胍基與芳香環(huán)的相互作用從而影響相分離的發(fā)生8,47。乙酰化酶/去乙酰化酶催化賴(lài)氨酸末端乙?；蛉ヒ阴；瘡亩淖兊鞍椎膸щ姞顟B(tài)，如去乙?；窰DAC6催化stress granule中DDX3XN端天然無(wú)序結(jié)構(gòu)域的乙?；?lài)氨酸去乙?；瑥亩龠M(jìn)相分離液滴的形成100。多泛素化修飾通過(guò)形成與泛素結(jié)合蛋白的多價(jià)作用，實(shí)現(xiàn)凝聚。

(2)通過(guò)改變參與相分離的生物分子的濃度。細(xì)胞通過(guò)激活/抑制基因的表達(dá)、改變mRNA可變剪接的方式，以及調(diào)整降解速率等改變總體濃度，或是通過(guò)定向輸運(yùn)等方式改變局部濃度。

(3)通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)的寡聚狀態(tài)。對(duì)于通過(guò)寡聚實(shí)現(xiàn)多價(jià)作用的體系，可以通過(guò)加強(qiáng)或干擾寡聚狀態(tài)的方式調(diào)控其相分離的能力。

(4)對(duì)于局部溶液環(huán)境敏感的相分離體系，可以通過(guò)調(diào)整這些溶液環(huán)境值影響相分離，如pH值，金屬離子濃度，ATP濃度等。例如酵母細(xì)胞在饑餓壓力下，pH值降低使stress granule生成。ATP作為細(xì)胞內(nèi)的高濃度、高電荷分子，在細(xì)胞內(nèi)充當(dāng)重要助溶作用，實(shí)驗(yàn)表明ATP可以顯著地減少FUS的聚集，促進(jìn)其聚集體的溶解101。

8.2 設(shè)計(jì)小分子調(diào)控生物分子相分離

設(shè)計(jì)小分子干預(yù)調(diào)控生物分子相分離過(guò)程可以依靠以上調(diào)控方式實(shí)現(xiàn)，其中最主要的是通過(guò)設(shè)計(jì)相關(guān)翻譯后修飾酶的調(diào)控分子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)相分離過(guò)程的調(diào)控。例如，Wippich等人88通過(guò)基于成像的篩選方法得到的抑制stress granule溶解的抑制劑大都是激酶的抑制劑，它們通過(guò)調(diào)控激酶的活性，來(lái)調(diào)控相分離基架蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而影響相分離。Aumiller和Keating設(shè)計(jì)了體外通過(guò)激酶/磷酸酶的磷酸化和去磷酸控制多肽可逆地聚集、溶解的體系，他們通過(guò)控制ATP的量控制激酶活性，通過(guò)控制Mn2+的濃度控制磷酸酶的活性102。相分離調(diào)控分子的設(shè)計(jì)的另外的思路是設(shè)計(jì)分子直接結(jié)合調(diào)控蛋白構(gòu)象、或者影響天然無(wú)序蛋白質(zhì)的構(gòu)象系綜以及多價(jià)作用的能力，干擾相分離的發(fā)生。1,6-己二醇分子是目前應(yīng)用廣泛的生物分子液-液相分離的非專(zhuān)一性抑制劑103，可能的機(jī)制就是影響了天然無(wú)序蛋白的構(gòu)象系綜。多聚物poly(ADP-ribose) (PAR)的性質(zhì)與核酸類(lèi)似，在細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控與核酸相關(guān)的相分離過(guò)程。Altmeyer等人發(fā)現(xiàn)在DNA損傷部位PAR水平顯著提高，并促進(jìn)FUS等含RGG結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相分離形成聚集體81。McGurk等人發(fā)現(xiàn)多聚物PAR結(jié)合于TDP-43的PAR結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后可以促進(jìn)TDP-43的相分離，在果蠅體內(nèi)促進(jìn)TDP-43富集進(jìn)入stress granule，從而保護(hù)該蛋白不發(fā)生疾病相關(guān)的磷酸化修飾104。Jin等人105揭示了天然無(wú)序蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的動(dòng)態(tài)特征，Yu等人106發(fā)展了針對(duì)天然無(wú)序蛋白質(zhì)構(gòu)象系綜進(jìn)行配體分子設(shè)計(jì)的方法，為相分離調(diào)控分子的設(shè)計(jì)提供了重要參考。此外設(shè)計(jì)小分子化合物調(diào)控相分離的重要功能客體分子進(jìn)入聚集體也有重要的價(jià)值。例如Fang等人107篩選發(fā)現(xiàn)了小分子化合物可以在細(xì)胞內(nèi)阻止TDP-43進(jìn)入應(yīng)激顆粒，從而抑制肌萎縮性側(cè)索硬化與額顳部癡呆(ALS/FTD)病變中TDP-43蛋白在神經(jīng)細(xì)胞中的累積。

9 總結(jié)與展望

生物分子相分離在生命活動(dòng)中扮演著富集、屏蔽、開(kāi)關(guān)、定位、生力等重要功能，這些功能與生物分子相分離的協(xié)同性、液滴的動(dòng)態(tài)性、專(zhuān)一的招募滲透性、較高密度和粘度等物理化學(xué)性質(zhì)緊密聯(lián)系的。這些物理化學(xué)性質(zhì)的微觀(guān)基礎(chǔ)是相分離各組分之間的弱而多價(jià)的相互作用，以及天然無(wú)序蛋白質(zhì)、無(wú)序連接鏈、以及單鏈核酸的構(gòu)象柔性等。序列突變、核磁共振等微觀(guān)結(jié)構(gòu)測(cè)量實(shí)驗(yàn)、以及分子模擬等研究手段已經(jīng)開(kāi)始揭示生物分子序列、結(jié)構(gòu)與相分離條件和聚集體性質(zhì)之間的關(guān)系，為深入理解生命體怎樣通過(guò)相分離實(shí)現(xiàn)復(fù)雜功能提供了定量或定性的數(shù)據(jù)支持。實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子相分離過(guò)程的精準(zhǔn)調(diào)控、干預(yù)相分離相關(guān)的疾病過(guò)程24是相分離研究的重要目的，設(shè)計(jì)翻譯后修飾酶的調(diào)控分子或是設(shè)計(jì)構(gòu)象調(diào)控分子是調(diào)控生物分子相分離的主要手段。

生物分子相分離過(guò)程所展現(xiàn)的普遍性表明當(dāng)前所發(fā)現(xiàn)的生命體內(nèi)的相分離分子可能只是冰山一角，未來(lái)需要從基因組及蛋白質(zhì)組的層次系統(tǒng)地發(fā)掘生命過(guò)程中的相分離事件和相關(guān)分子，整理出生命系統(tǒng)虛(溶液分散相)-實(shí)(聚集相)轉(zhuǎn)換的條件和調(diào)控途徑。更深入地理解生物分子序列、結(jié)構(gòu)與相分離條件和聚集體性質(zhì)之間的關(guān)系，可以從構(gòu)建新的模式體系、采用更精確定量的實(shí)驗(yàn)方法、以及更準(zhǔn)確的分子模擬方法這些方面入手。以可極化力場(chǎng)為代表的新一代生物分子力場(chǎng)108,109提供了更為可靠的靜電作用、偶極作用、π-π作用110等這些在相分離體系中最關(guān)鍵的分子間相互作用力的計(jì)算方法，有可能為生物分子聚集現(xiàn)象展現(xiàn)出不同于經(jīng)典力場(chǎng)的圖景，比如更為顯著的分子協(xié)同性。另外利用更準(zhǔn)確的力場(chǎng)研究天然無(wú)序蛋白質(zhì)的構(gòu)象系綜，并設(shè)計(jì)分子改變其構(gòu)象系綜111，從而改變天然無(wú)序蛋白質(zhì)的相分離行為，可能是專(zhuān)一性地直接調(diào)控相分離的有效方法。