活血通絡丸質量標準研究

曹雪芹 曹鑫善 王 剛 張生杰 龐文娟

（1、武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威733000 2、武威市質量計量檢驗檢測中心，甘肅 武威733000）

活血通絡丸是武威職業學院直屬附屬醫院自行研發并在臨床使用多年的中藥制劑，處方由：丹參、雞血藤、乳香（炙）、沒藥（炙）、全蝎、法半夏、膽南星、香附（炙）、祖師麻、黃芪、甘草等十四味中藥組成。主要在止痛、通絡等方面展現出較好的功能療效。在類風濕性關節炎、關節變形、僵硬等方面被臨床廣泛應用。臨床主要用其進行治療游走不定，遇寒痛劇，關節曲伸不利或有腫脹諸證。 原標準僅收載了顯微鑒別和理化鑒別，質量標準簡單落后，不能有效控制制劑質量。以提升產品質量標準對產品質量實行精準高效控制作為目標導向，綜合各方面因素，本文擬定了香附、丹參、乳香、雞血藤的薄層鑒別方法，并通過采用高效液相色譜法，對生產制劑中的丹參酮ⅡA 進行含量測定，從而進一步健全質量標準，對該制劑生產具備了可信性的參考指標，并對其進行質量控制。

1 試藥 儀器

選擇的儀器為：Agilent1260 高效液相色譜儀；賽多利斯科學儀器（北京）有限公司CPA225D、瑞士普利賽斯XT120A 電子分析天平；KH-205DB 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。原兒茶醛對照品（批號：0810-9803 生產單位：中國藥品生物制品檢定所），丹參酮IIA對照品（批號：110766-201721供含量測定用），香附對照藥材（批號：121059-20070）、乳香對照藥材（批號：120970-201305）、雞血藤對照藥材（批號：121173-201604）、芒柄花素對照品（批號：111703-2015 -04），生產單位：中國食品藥品檢定研究院。在此次研究當中涉及到的活血通絡丸樣品和陰性對照樣品，均由武威職業學院附屬醫院供給，在研究之中涉及到的水均為重蒸餾水，其余相關試劑、試藥皆是分析純。

2 鑒別

2.1 香附的TLC

取本品適量（約10g），研碎，加乙醚50ml，浸漬30 分鐘，振搖，濾過，濾液蒸干，將1ml 乙醇滴加于殘渣使其溶解得到供試液。取0.98g 香附對照藥材，同法制成對照藥材溶液。再以供試品溶液的制備方法為依據，進行陰性樣品溶液的制取。各吸取2ul 上述溶液，在硅膠GF254 薄層板上分別進行點樣，展開劑選擇為石油醚（60-90℃）- 乙酸乙酯（3:2），隨后進行展開操作，展開完成后取出薄層板晾干，噴以香草醛硫酸溶液，濃度為1%，進行烘干，使用儀器為恒溫干燥箱，烘干溫度：105℃，時間：10min，隨后使用紫外光燈（365nm）對其開展檢測。在薄層色譜中，斑點呈現的顏色和色譜位置與對照藥材呈現出較好的一致性。陰性對照液未發現對應斑點存在，具體如圖1 所示。

圖1 活血通絡丸中香附的TCL 圖

2.2 丹參的TLC 鑒別

取本品適量（約10g），研碎，加水40ml，加熱回流1 小時，放冷,濾過，濾液加稀鹽酸調節PH 值至2～3，加乙醚振搖提取3次，單次滴加的乙醚劑量為20ml，合并乙醚液，回收溶劑至干燥狀態并取其殘渣。用0.6ml 的乙酸乙酯滴入殘渣使其溶解，將制得的溶液作為供試品溶液。精密稱取0.0097 g 的原兒茶醛對照品，加乙酸乙酯10ml，制備對照品溶液，要求為每1ml 含1mg。以供試品溶液制備方法作為參照，對陰性樣品溶液進行制取。各吸取10ul 上述溶液，在硅膠G 薄層板上分別進行點樣，展開劑選擇為甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸（6:3.2:0.8），隨后進行展開操作，完成后取出薄層板，噴以三氯化鐵溶液，濃度為2%。在薄層色譜中，斑點呈現的顏色和色譜位置與對照品呈現出較好的一致性。陰性對照液未曾發現對應斑點存在，具體如圖2 所示。

圖2 活血通絡丸中丹參的TCL 圖

2.3 乳香的TLC 鑒別

取本品適量（約10g），研碎，置具塞錐形瓶中，加乙醚50ml，進行超聲處理，時間為25min，將溶液進行濾過，溶劑回收至干加1.00ml 乙醇使其溶解，得到供試品溶液。同法對對照藥材溶液進行制備，對照藥材為1.00g 乳香，溶劑為25ml 乙醚。取缺乳香陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，進行陰性樣品溶液的制取。各吸取2ul 上述溶液，在硅膠G 薄層板上分別進行點樣，展開劑為甲苯- 乙酸乙酯（比例19:1），隨后進行展開操作，展開完成后取出薄層板晾干，其以噴香草醛硫酸溶液，濃度為5%，烘干，使用儀器為恒溫干燥箱，烘干溫度：105℃，至斑點顯色明晰即可停止。在薄層色譜中，斑點呈現的顏色和色譜位置與對照品呈現出較為良好的一致性。陰性對照液未曾發現對應斑點存在，具體如圖3 所示。

圖3 活血通絡丸中乳香的TCL 圖

2.4 雞血藤的TLC 鑒別

取本品適量（約10g），研碎，加80%丙酮100ml，進行超聲處理，時間為35min，對溶液進行濾過操作，將溶劑回收至干后滴加1.00ml 甲醇使其溶解，得到供試品溶液。同法進行對照藥材溶液的制備，對照品溶液中對照品為0.0098g 芒柄花素，溶劑為10.00ml 甲醇。取缺雞血藤的陰性樣品，照供試品制備方法，進行陰性樣品溶液的制備。各吸取5ul 上述溶液，在硅膠GF254 薄層板上分別進行點樣，展開劑選擇為三氯甲烷- 甲醇（比例20:1），進行展開操作，完成后取出薄層板晾干，隨后將其置于紫外光（波段254nm）條件下進行檢視。在薄層色譜中，斑點呈現的顏色和色譜位置與對照藥材呈現出較好的一致性。陰性對照液未曾發現斑點存在，具體如圖4 所示。

圖4 活血通絡丸中雞血藤的TCL 圖

3 含量測定

丹參酮ⅡA的含量測定:

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取丹參酮ⅡA對照品0.01282g ，置棕色容量瓶中，加甲醇50ml 定容，再量取1ml 到10ml 容量瓶中，溶液配比要求為25.64ug/ml。

3.2 供試品溶液的制備

精密稱取本品內容物1.0006g，置容量瓶中，加25.00mL 甲醇，隨后進行重量稱定，操作完成后對其進行超聲處理，超聲時間為30min，將溶液置于自然條件下進行冷卻后再次進行重量稱定，缺損重量加甲醇補全，將溶液搖勻后進行濾過，量取續濾液1.00ml 到10ml 容量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.3 陰性對照溶液制備

對自制陰性樣品（不含丹參）進行提取，所選擇的方法為“供試品溶液的制備”的方法，得陰性樣品溶液。

3.4 色譜條件及系統適用性試驗

色譜條件設定為：色譜柱、流動相、甲醇－水比例、流速、檢測波長、柱溫、進樣量分別為Phenomenex——C18 (250mm×4.6mm，5μm)、75:25、1.00mL.min-1、270nm、30℃、10.00μL。

圖5 HPLC 色譜圖

分別取10.00μL 對照品、樣品供試品、陰性對照品溶液進行進樣，之后得出結果。在供試品色譜之中，丹參酮ⅡA峰與相鄰分峰呈現基線分離，并陰性對照未現干擾，呈現出峰形對稱，有良好的分離效果。圖5 可見具體HPLC 圖譜。

3.5 考察線性關系

分別吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL 的甲醇溶液（丹參酮ⅡA濃度256.4 ug.mL-1）放置于l0mL 量瓶，再使用甲醇進行稀釋，至標準刻度為止。在上述色譜條件作為基礎，分別進樣10μL 開展對于溶液的測定，將峰面積（A）對濃度（C）作為參照指標開展線性回歸的描述，可以得到A=70.17134，C-39.07452,r=0.9997的方程。此方程的意義表現為（25.64～128.2）ug.mL-1的濃度范圍之內，丹參酮ⅡA可以展現為較好的線性關系。

3.6 精密度試驗

取10μL 對照品溶液，儀器選擇為高精度移液管。重復5 次進樣，通過計算得出5 次峰面積的RSD 值為0.12%。

表2 樣品含量測定結果

3.7 穩定性試驗

對照品、供試品溶液進行精密量取，置于室溫，在上述同樣的色譜條件下，分別于0h,1h,2h,4h,8h,12h 進行10.00μL 進樣，之后進行峰面積測定。分別計算對照品以及供試品RSD，數值為0.50%、0.22%,分析結果可以得出結論，即在12h 的時間內，對照品和供試品溶液有良好的穩定性。

3.8 重復性試驗

制備6 份相同活血通絡丸（批號180123）樣品，以樣品測定法作為參照標準，進行丹參酮ⅡA的含量測定，結果表明其RSD=0.30%，可以看出此法具備較好的可重復性。

3.9 回收率試驗

加樣回收法，取已知含量的活血通絡丸(批號--180123，含量0.13mg／g)。精密稱定，取6 份，各加入丹參酮ⅡA標準品溶液（濃度：256.4ug.mL-1）3mL，3 mL，4 mL，4 mL，5 mL，5 mL，按上述樣品溶液方法進行制備，色譜條件和以上一致，測定丹參酮ⅡA 含量，結果表明平均回收率達到100.68%，RSD 值為0.35%（表1）。

3.10 樣品含量測定

取3 批樣品進行供試品溶液制備，色譜條件和以上一致，各取10μL 對照品溶液及供試品溶液，加入液相色譜儀，對丹參酮ⅡA含量進行計算，方法選擇為外標法，具體結果如表2 所示。

4 討論

4.1 本試驗中香附、乳香、丹參、雞血藤展現出較清楚的薄層鑒別斑點，不存在陰性對照所產生的干擾，表現出較為良好的分離度，對于其制劑可以作為定性控制指標。對于處方當中所涵蓋的其余成分，在相關薄層鑒別方法方面還存在著較大的提升空間。對丹參及其制劑中丹參酮ⅡA通過HPLC 進行含量測定，在相關研究當中已經有所提及[1-4]，本文用HPLC 法建立了活血通絡丸中丹參酮ⅡA的含量測定，此種方法的優越性主要體現在有較強的可操作性，高度的準確性，以及可重復性，綜上所述，此種方法能夠成為此制劑的定量控制指標。

4.2 提取活血通絡丸中丹參酮ⅡA時，超聲提取10、20、30、40min 與加熱回流60min 丹酚酸ⅡA的提取效果基本相同，提取手段最終選用超聲30min 后，直接進樣測定，方法簡便快速，結果可行。

4.3 HPLC 在對丹參酮ⅡA含量進行測定過程中，進行甲醇-水的不同比例對比，顯示結果以甲醇－水(比例75:25)作為流動相，色譜圖峰型好，出峰時間適宜，分離效果較好。