白喉棒狀桿菌在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的染色方法改良

陳劍煌，周紅，黃錦桃，李美玉

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510008）

白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae）是棒狀桿菌屬里最重要的對(duì)人類致病菌，需氧或兼性厭氧，致病時(shí)主要侵犯人的咽部形成灰白色假膜，俗稱白喉，并能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素，擴(kuò)散至多種器官中引起現(xiàn)變，嚴(yán)重時(shí)可引致死亡[1]。因此，在病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，白喉棒狀桿菌是該屬中唯一用作示教的病原體。該菌體細(xì)長(zhǎng)、微彎曲，菌體一端或兩端稍膨呈棒狀，排列不規(guī)則，常呈L、V、Y形或呈柵欄狀。該菌為革蘭陽(yáng)性菌，短時(shí)間染色時(shí)，菌體著色不均勻，易出現(xiàn)有濃染的顆粒，稱為異染顆粒。異染顆粒主要成分是核糖核酸和多偏磷酸鹽，在鑒定時(shí)有重要意義。

白喉棒狀桿菌使用的染色方法有革蘭染色法、美藍(lán)染色法、Albert染色法、Neisser染色法等，其中以Neisser染色法使用的比較多[2]。用傳統(tǒng)的Neisser染色法進(jìn)行染色后，菌體可被染上淡褐色，并可見(jiàn)明顯的深藍(lán)色異染顆粒，如此制作出的示教玻片可用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，大多數(shù)情況下異染顆粒清晰易見(jiàn)，但菌體顏色偏淡，在光源光線偏強(qiáng)和偏弱時(shí)均不易看清菌體。玻片在1-2年后出現(xiàn)菌體染色變淡的現(xiàn)象，異染顆粒也在2-3年后相繼褪色。本實(shí)驗(yàn)嘗試對(duì)Neisser染色法進(jìn)行改良，探索更穩(wěn)定的染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 白喉棒狀桿菌38101，來(lái)自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的菌毒種庫(kù)，-80 ℃超低溫保存。

1.1.2 培養(yǎng)基配制 將新鮮雞蛋用肥皂水及清水洗凈蛋殼，浸于75%酒精中30 min，取出以無(wú)菌紗布擦干，以無(wú)菌鑷子在蛋殼氣息尖端開(kāi)一小孔，打開(kāi)蛋殼，將全部蛋倒入盛有玻璃珠的無(wú)菌三角燒瓶?jī)?nèi)，充分搖勻。無(wú)菌量取蛋液300 mL加入滅菌生理鹽水100 mL，混勻后用兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾。加入甘油4 mL，混勻分裝中試管，每管4-5 mL，置血清凝固器內(nèi)制成斜面，80-85 ℃加熱30 min，采用間歇滅菌法，連續(xù)3 d。

1.1.3 染色液配制

1.1.3.1 俾斯麥褐液 取俾斯麥褐0.2 g溶于100 mL 100 ℃蒸餾水中，冷卻后過(guò)濾。

1.1.3.2 奈瑟氏美藍(lán)液：美藍(lán)1 g研磨溶解于2 mL 95%酒精中，加冰醋酸5 mL及蒸餾水95 mL，混合，24 h后過(guò)濾。

1.2 方法

1.2.1 涂片 復(fù)蘇菌株后接種于雞蛋培養(yǎng)基斜面上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。滴一滴生理鹽水于載玻片上，以接種環(huán)從雞蛋培養(yǎng)基上挑取少量菌體，在生理鹽水中均勻涂布于載玻片上，等待干燥，置烤片機(jī)上60 ℃烤1 min。

1.2.2 染色 先以俾斯麥褐液染色1 min，蒸餾水沖洗，甩干。后以奈瑟氏美藍(lán)液染色1.5 min，蒸餾水沖洗，甩干后油鏡下觀察。

2 結(jié)果

染色后的白喉棒狀桿菌在油鏡下可見(jiàn)菌體染成藍(lán)色，形狀清晰可見(jiàn)，細(xì)長(zhǎng)、微彎曲，一端或兩端稍膨大呈棒狀，排列不規(guī)則，常呈L、V、Y、X形等形狀。菌體著色不均勻，異染顆粒呈深藍(lán)色。在大多數(shù)條件下菌體輪廓均可辨認(rèn)。改良的染色方法制作的白喉棒狀桿菌玻片標(biāo)本在1年后放油鏡下觀察（圖1）與傳統(tǒng)Neisser染色法制作的玻片標(biāo)本（圖2）相比，能更好地保持菌體上的顏色。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)將Neisser染色法中的A、B液調(diào)換順序，經(jīng)此改良后的染色法制作出來(lái)的白喉棒狀桿菌玻片標(biāo)本可改善菌體顏色不清晰的缺點(diǎn)，得到具有清晰邊界的藍(lán)色菌體，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。玻片標(biāo)本中的菌體和異染顆粒在1-2年后顏色仍然清晰未有褪色，可長(zhǎng)期保存。

白喉棒狀桿菌的染色結(jié)果與多種因素有關(guān)，如菌株差異、培養(yǎng)基情況、染色液的種類和新舊程度等[3]。本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株為本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用，經(jīng)多年傳代接種，與臨床中流行的菌株差別較大，因此本方法對(duì)臨床菌株的適用性有待進(jìn)一步研究。