SBBR反應器中耐冷微生物的馴化與識別

吳涵，陳瀅，劉敏，王淑瑩，張偉

（1 四川大學建筑與環境學院，四川成都610065； 2 北京工業大學城鎮污水深度處理與資源化利用技術國家工程實驗室，北京100124； 3 四川大學高分子研究所高分子材料工程國家重點實驗室，四川成都610065）

引 言

在我國，污水處理廠多使用生物法處理污水[1]，該方法在常溫下運行效果較好。但是我國北部地區及西部高寒地區常年低溫（例如四川阿壩州高原常年氣溫為3.1～16.3℃[2]），使得微生物活性受到影響，硝化作用急劇下降，影響出水水質。有研究表明，溫度對微生物代謝過程影響較大，特別是硝化菌容易受到溫度的影響，溫度低于15℃后，細菌生物活性變差[3]；低于5℃進入極端環境后，污水處理效果大幅下降[4]。改善這一問題的傳統方法除調整傳統的活性污泥法系統的運行參數之外[5]，主要有化學強化混凝[6]、人工濕地強化[7]、投加高效耐冷菌種技術[8]等強化低溫污水的處理效果。近年來，大多數生物法處理低溫污水的研究多集中在顆粒污泥培養[9]和生物強化技術[2]上，但其工藝措施仍有不足，甚至可能引起污泥膨脹問題[10]。耐冷菌的富集強化技術成為了解決方案之一。

序批式生物膜反應器（sequencing biofilm batch reactor，SBBR）工藝將活性污泥法和生物膜法相結合[11]，它增加了每單位反應器體積的生物量群的大小和微生物多樣性，從而創造了提高污染物生物降解效率的條件，且填料的存在避免了污泥膨脹問題。近年來，隨著微生物分子生態學研究的發展，以Illumina 為代表的高通量測序技術[12]因其測序成本低、信息采集量大、適用性廣的優點逐漸被熟識，將高通量測序技術與污水處理菌種篩選相結合更有利于對生物膜微生物群落水平的分析和鑒定[13]。

本實驗則旨在對以SBBR 方式運行的反應器進行逐步降溫，并比較分別使用不同填料的三個反應器在低溫下的出水水質差異。進一步對填料上的微生物進行16S rRNA 高通量測序。既利用SBBR工藝的優點，又在微生物群落水平上解釋不同反應器理化指標的差異并識別出耐低溫的污水處理微生物，同時對比選擇出更有利于低溫微生物生長的填料載體，為進一步富集低溫菌，投入低溫污水處理的使用提供依據和支撐。

1 實驗部分

1.1 實驗裝置與材料

設計了3個有效容積800 ml的完全相同的反應器，放在同一恒溫控制箱內，24 h 在線監測，結果顯示，溫度波動在±0.1℃內。低溫實驗階段是在冬季進行，能夠保證在預設溫度內開展。三個反應器分別按填料比80%放置三種不同的填料，分別命名為A 反應器、B 反應器、C 反應器。三個反應器均以序批式方式運行，換水比為50%，每個溫度下具體曝氣時間、靜置時間安排見表1。

A反應器使用普通商用聚乙烯懸浮填料作為實驗對照組，形狀規格為白色柱狀，直徑2.5 cm，厚1 cm；B反應器中為自制陽離子改性聚乙烯懸浮填料，淡黃色柱狀，直徑2.5 cm，厚1 cm；C 反應器為石墨烯改性聚乙烯懸浮填料，黑色柱狀，直徑2.5 cm，厚0.4 cm，具體填料樣式如圖1所示。

1.2 接種污泥及配水

圖1 三種填料Fig.1 Fillers in three reactors

接種污泥為成都市某污水處理廠的回流污泥，其混合液懸浮固體濃度（mixed liquid suspended solids, MLSS）為(5500±50) mg/L。實驗用水為模擬中試現場配制的生活污水，其化學需氧量(COD)為(300±40)mg/L，氨氮為(30.0±3.00)mg/L，總磷（TP）為(4.00±0.20) mg/L，并加入NaHCO3保證足夠的堿度，使pH=6～8，設置生物膜培養的初始溫度為25℃，三個反應器曝氣流量一樣，DO＞4.5 mg/L。

1.3 實驗方案

實驗具體方案如表1 所示，三個反應器除使用填料不同外，進水、接種污泥及濃度以及運行條件都完全相同。實驗分為兩個階段：第一階段為常溫下生物膜培養馴化階段：接種污泥后，三個反應器在25℃下運行140 個周期。在運行到第20 個周期時，COD 去除率達80%以上時，抖動填料后，排掉所有懸浮和脫落污泥。第二階段為逐步降溫正式運行階段：在25、20、15、10、6和5℃下依次降溫運行不同周期。每周期對應污染物去除負荷計算公式如式（1）所示

式中，LB為去除負荷，g 污染物/(m3·d)；n為一日之內的周期數，周期/日；Q為一周期內的進水流量，立方米/周期；C0、Ce分別為進水、出水污染物濃度，g/m3；Tc為一個處理周期的時間，h；V為反應器有效容積，m3；Ta為一個處理周期內反應的有效時間，h。

表1 實驗方案參數Table 1 Experimental protocol parameters

各反應器脫氮表觀活化能Arrhenius 計算公式如式（2）所示[14]

式中，r為脫氮速率，kg N/(m3·d)；Ea為表觀活化能，J/(mol NH3-N)；R為摩爾氣體常量，8.314 J/(kg·K)；T為熱力學溫度，K；A為指前因子。

1.4 水質檢測方法

第一階段每2 個周期，第二階段每個周期取進水、出水水樣進行水質測定。每個溫度條件下最后一個周期取填料上的生物膜進行鏡檢觀察。采用快速消解分光光度法（HJ/T 399—2007）測定COD，檢測儀器為5B-2H 便攜多參數水質分析儀；采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009）測定氨氮濃度，檢測儀器為L5S 紫外分光光度計；采用電化學測量法測定DO，檢測儀器為WTW Multi3430便攜式溶氧測定儀；采用玻璃電極法測定pH，檢測儀器為HI98128 pH 測試儀；采用重量法測定MLSS，檢測儀器包括分析天平、101-2 電熱鼓風干燥箱；微生物鏡檢儀器為OLYMPUS BX51 系統顯微鏡。

1.5 16S rRNA高通量測序

取5℃下穩定運行后的三個反應器填料上的生物膜進行測序。測序鑒定工作由羅寧生物公司完成，具體的實驗方法如下：生物膜總RNA 提取使用RNeasy PowerSoil Total RNA Kit（QIAGEN 公 司）完成，隨后使用5X All-In-One RT MasterMix（ABM 公司）逆轉得到第一連cDNA 并定量。用KOD-Plus-Neo（TOYOBO）高保真酶對cDNA 進行PCR 擴增，PCR 所用引物已經融合了Miseq 測序平臺的16S rDNA V4 通 用 引 物 ，515F 引 物 ：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'；806R 引 物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。每個樣本進行3個重復，每個PCR 反應終止于線性擴增期，PCR 結束后將同一樣本的PCR 產物混合后進行電泳檢測，使用膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA 片段。參照電泳初步檢測結果，將PCR 回收產物用Qubit 2.0（ThermoFisher 公司）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用Illumina 公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit (FC-121-3001/3003)建庫試劑盒進行文庫的構建。將混合好的文庫用Illumina MiSeq 測序儀測序并分析。

1.6 測序數據分析方法

測序得到的原始下機數據經過拼接后，再根據Barcode 區分樣品，使用UCHIME 算法去除低質量序列和嵌合體。利用UPARSE 算法在97%的相似性水平上進行OTU（operational taxonomic units）的聚類，篩選OTU 的代表性序列，使用SILVA 數據庫進行物種分類信息的劃分，對代表性序列進行比對并過濾，然后重構建進化樹，過濾掉不需要的OTU 并進行重抽樣，并計算各個分類水平上的豐度信息。統計和作圖主要使用R、python 和java 等完成，用R分析微生物群落的Alpha多樣性。

2 實驗結果與討論

2.1 反應器去除污染物效果

經過第一階段長時間的生物膜培養，A、B 和C三個反應器COD 出水濃度分別達到26、37和39 mg/L，氨氮出水濃度分別為0.43、1.07和0.52 mg/L，均降低至《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB 18918—2012）的一級A 類排放標準以下。第二階段正式降溫運行過程中，25℃時三個反應器出水水質相近。隨著溫度的降低，污染物的去除效果在不同溫度以及不同反應器下產生了差異，A 反應器填料上的生物膜有部分脫落，B、C反應器生物膜生長情況較好。由于每次溫度降低后微生物的活性都會受到影響，處理效果有所波動，所以取每個溫度下運行最穩定的最后6 個周期的去除負荷、出水濃度和污染物去除率的平均值進行分析比較。

2.1.1 COD 去除效果 隨著溫度的降低，微生物的活性逐漸降低，如果不改變曝氣時長，COD 去除效果會變差，為了達到排放標準對水質的要求，實驗在第二階段降溫過程中延長了每周期的曝氣時間，導致圖2 中去除負荷隨溫度的降低而降低。25℃的平均去除負荷是5℃的近三倍，15℃與20℃相比去除負荷下降最快，三個反應的平均去除負荷由300 g COD/(m3·d)下降到100 g COD/(m3·d)，5℃和6℃的有機物去除效果相近。雖然總體的去除負荷有明顯的降低，但使用三種不同填料的SBBR 在相同溫度下的去除負荷相近，對有機物的去除效果差異不大。

溫度下降的過程中，為了保證出水水質達標延長了曝氣時間，由圖3可知，在選取了合適的去除負荷后，三個反應器COD 去除率均達到80%以上，其出水濃度都穩定在50 mg/L 以下，且沒有明顯隨溫度降低而變化的趨勢。這說明不同溫度下，選取了合適的去除負荷，填料的類型對COD 的去除不會有太大影響。

圖2 不同溫度下COD的去除負荷箱式圖Fig.2 COD removal load at different temperatures

圖3 不同溫度下COD出水情況統計圖Fig.3 COD effluent at different temperatures

2.1.2 氨氮去除效果 在污水處理中，氨氮是監測出水水質的重要指標之一，較高的氨氮濃度易造成水體富營養化等水質問題。

溫度降低影響了硝化菌的活性，使出水氨氮濃度難以達標。采取延長曝氣時間來降低去除負荷保證至少一個反應器出水濃度達標。由圖4 可知，25℃時，三個反應器的氨氮去除負荷并無太大差別。與COD 去除情況不同的是，隨著溫度的降低，三個反應器對氨氮的去除情況產生了差異，使用自制填料的B反應器的氨氮去除負荷在各個溫度下均高于其他反應器。箱式圖的垂直延伸線代表了所有數值在四分位數以外的可變性，由圖對比可知隨著溫度的降低，B 反應器的氨氮去除效果可變性較小，尤其是在6℃和5℃時，B 反應器去除負荷數值較集中且極端值偏差不大，穩定性高于A、C 反應器。這說明B反應器中的自制填料更有利于微生物的穩定生長，其中的微生物在低溫下對氨氮的去除能力更強，效率更高，且去除效果更加穩定，出現極端情況的可能性小。

由圖5可得，經過第一階段的長期馴化，三個反應器氨氮去除率均穩定在90%以上。在25℃時出水情況基本相同，降溫到20℃時出現差異，A反應器氨氮出水濃度為13.7 mg/L，B 反應器為4.36 mg/L，C反應器為14.1 mg/L，B 反應器遠好于A、C 反應器的出水效果。隨著溫度的繼續降低，每個溫度下B 反應器的去除率始終較高。在5℃時，三個反應器中氨氮的出水濃度分別為14.1、3.79 和14.1 mg/L，B 反應器出水濃度始終達標。另外，圖6 為A、B、C 三個反應器脫氮速率與熱力學溫度的關系圖，由Arrhenius 計算公式得到A、B 和C 三個反應系統的表 觀 活 化 能 分 別 為68.96、57.48 和62.98 kJ/mol。Arrhenius 公式可用來量化生物反應對溫度的依賴性[14]，表觀活化能越高，對溫度的變化越敏感。由此可知，接種原始污泥后，三個反應器的生物系統隨著溫度的改變發生了不同的變化，A、C 反應系統更易受到溫度變化的影響，脫氮效果因低溫變差，而B反應器的生物系統進化得更加穩定，抵抗低溫能力較強，保證了出水水質達標。由以上可說明，以商用填料作為對照，B 反應器中的自制填料更有利于微生物在常溫和低溫下的附著和生長，適合進行深入研究與開發應用。

圖4 不同溫度下氨氮去除負荷箱式圖Fig.4 NH3-N removal load at different temperatures

圖5 不同溫度下氨氮出水情況統計圖Fig.5 NH3-N effluent at different temperatures

圖6 三個反應器的脫氮速率與熱力學溫度的關系Fig.6 Relationship between nitrogen removal rate and thermodynamic temperature

表2 所示為本研究與近年其他文獻報道的對低溫條件下氨氮去除的研究。艾勝書等[15]利用多段多級AO 生物膜工藝在10℃條件下去除氨氮，降低溫度后出水效果無法保證；張斌等[16]在四川高寒地區運用改良型A2/O工藝在低溫下進行脫氮，其技術先進可靠，運行成本低，但10℃以下難以保證出水效果；Feng 等[17]利用沸石的離子交換作用和細菌的硝化作用在低溫下同時吸收氨氮等污染物，在6℃低溫下可達到較好的氨氮去除效果，但沸石的重復利用還需要人工投藥進行解吸，操作煩瑣；伍海全等[2]則利用生物強化技術對照投加經低溫馴化后的耐冷菌和未經馴化的硝化菌觀測出水中氨氮濃度，其菌種由LB 培養基培養得到，進水氨氮濃度較低，且實驗運行周期較短，無法保證在有大量復雜污染物的生活污水中長期投用。本研究中以自制填料B 為載體培養的生物膜在低溫5℃時，進水氨氮濃度為30 mg/L，去除負荷達到10.88 g 氨氮/(m3·d)時，出水氨氮濃度為3.79 mg/L，達到一級A 類標準的要求?？蓱糜诒狈蕉净蚋吆貐^的污水處理廠。為探究與這些理化指標相關的微生物生長情況，實驗進一步分析了反應器內的微生物生長情況與其群落結構之間的關系。

表2 近年來其他組對低溫條件下氨氮去除的研究Table 2 Comparison of other groups in recent years on NH3-N removal under low temperature conditions

2.2 生物膜鏡檢結果

微型動物數量是表示污泥性質、運行環境和出水水質的指標[18]，但對其在不同溫度下分布情況的研究較少。因本研究中B反應器出水效果遠好于其他反應器，所以重點觀察了B 反應器運行過程中微型動物中鐘蟲[19]、輪蟲[20]和線蟲[21]的情況。如表3 所示，在25℃時，鐘蟲、輪蟲與線蟲均數量較多且活性較高。20℃時鐘蟲、輪蟲減少，線蟲數量變化不大，在6℃時鐘蟲和輪蟲基本消失，只剩下少量線蟲?？梢婋S著溫度的降低，鐘蟲、輪蟲都因不適應環境逐漸消失死亡，而線蟲對其環境的改變仍有一定適應能力。

2.3 微生物群落結構分析

本研究采用16S rRNA 高通量測序技術來探究活性污泥中微生物的種類，從微生物群落結構水平解釋理化指標上的差異性。

表3 不同溫度下微生物鏡檢結果Table 3 Microbiological examination results at different temperatures

2.3.1 COD 去除相關菌屬的分析 為了方便研究樣本的物種組成及多樣性信息，通常在97%的相似水平下進行OTU（operational taxonomic units）聚類分析。每個OTU 代表的是一類相似序列的集合，基于OTU 豐度表和注釋后的分類信息表，可得到在屬水平對各個樣本的相對豐度表。而相對豐度較大的優勢菌屬則在反應體系中主導污染物的去除。

低溫情況下，三個反應器對COD 的去除情況差別不大，且出水濃度都在50 mg/L 以下，高通量測序結果顯示，在豐度前五十的OTU 中，與去除COD相關的OTU 種類多達14 種,豐度占全部菌屬的53.73%（圖7），而去除氨氮的相關菌屬豐度低，種類少，由此可說明與COD 去除相關的菌屬為反應體系中的優勢菌，在低溫下對污水的有機物處理效果較好。

為進一步解釋三個反應器出水效果差異較小的原因，對去除COD 相關微生物中豐度最高的四種菌屬的屬水平豐度進行進一步的分析討論，如表4所示。其中Saprospiracea為腐螺旋菌，在低溫下易大量增殖且生長穩定[26]；Sphingomonas為鞘氨醇單胞菌，可分解有機物，且對環境變化具有極強適應能力，曾被發現于南極海冰中，對低溫適應性強[27]。各反應器中四種菌屬的豐度總和差別不大，這與實驗結果中三個反應器出水COD 濃度全部達標且相差不大的結論相吻合。

表4 豐度最高的前四種去除COD微生物屬水平豐度Table 4 Abundance of the top four depleted COD microbes

2.3.2 氨氮去除相關菌屬的分析與篩選 前期的實驗中，污泥中細菌即使死亡，由于DNA 沒有及時降解，提取DNA 測定細菌種類時會干擾測定結果，本研究在高通量測序時，提取的是RNA 而不是DNA。主要是因為細菌的RNA 在細胞中的半衰期很短，降解快速，可以保證是活細菌中的RNA。采用提取總RNA 分析細菌組成的方法可以最大程度保證測序結果分析的是活菌。

圖7 5℃時OTU豐度前五十菌屬分布餅狀圖Fig.7 Distribution of the top 50 genus of OTU abundance at 5℃

與消耗COD 的菌屬相比，與去除氨氮相關的菌屬種類較少，豐度也很低，在高通量測序技術檢測到的245 種菌屬中，僅有10 種菌屬是已有文獻報道的與污水中氨氮的去除有關，這說明硝化系統的菌種對溫度變化非常敏感，在5℃的低溫下，大多數普通硝化菌進入休眠狀態。如表5 所示，在這10 種菌屬中，Ellin6067[29]、Cm1-21、MND1、Nitrosomonas和966-1均屬于Nitrosomonadaceae（亞硝化單胞菌科），是城市污水處理廠活性污泥中氨氧化菌的優勢菌[33]，該菌科在三個反應器中豐度分別為1.91%、5.10%和3.24%。Rhodocyclaceaesp.為常見的反硝化聚磷菌[30]，在三個反應器中豐度為1.02%、5.01%和0.68%，都是在B中豐度較高，利于去除氨氮。

表5 氨氮去除相關微生物屬水平豐度Table 5 NH3-N removal related microbial abundance

Elstera屬 于 α 變 形 菌 門（Alphaproteobacteriales）[28]，該菌屬在A、C 反應器中豐度遠高于B 反應器，與硝化菌在三個反應器中的分布情況相反，其具體功能目前沒有文獻報道。但是該菌屬的16S rRNA 序列與巴西固氮螺菌（Azospirillum）的序列具有91%的相似性[34]。而巴西固氮螺菌具有將空氣中的分子態氮轉化成氨的固氮能力，由此推斷Elstera菌屬也可能有相似的作用，對氨氮的去除不利。

Nitrospira為常見的硝化螺旋菌，是硝化廢水處理廠中的主要亞硝酸鹽氧化細菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）[35]，直到2007 年，Alawi 等[31]在多年凍土中才發現了新的NOB——CandidatusNitrotoga，并且從活性污泥中富集了近親。Candidatus Nitrotoga為 一 種 新 型 的 β 變 形 菌（Betaproteobacteriales），可在低溫下功能性地代替Nitrospira進行硝化作用[36]，該菌屬在三個反應器中豐度分別為0、1.05%和0.01%，同時Nitrospira在三個反應器中豐度分別為0、0.02%和0.01%，這可以說明B反應器中氨氮的去除與這兩類硝化菌屬在低溫下良好的硝化作用有關。

另外，在接種原污泥的微生物種群分析中未發現CandidatusNitrotoga的存在，說明該菌種只能在低溫下生存，是由實驗在低溫下馴化培養出來的，與韓梅等[36]的研究結果吻合。

以某一菌屬在三個反應器中豐度總和為底數，計算其在各反應器中分布百分比，并以此作圖8 可以將豐度較小的菌種在反應器中的分布差異放大，便于分析篩選雖然豐度小但造成了組間差異關鍵菌種。由圖8 可見，大多數與氨氮去除相關的菌屬在B 反應器中豐度較高，尤其是Candidatus Nitrotoga在A、C 反應器中分布幾乎為零；Elstera在A、C 反應器中分布較多，在B 中分布較少。以上結果與前文中氨氮在不同反應器中去除效果不同的理化數據一致。

圖8 與氨氮去除相關菌種在各反應器中所占百分比堆積條形圖Fig.8 Percentage of strains associated with NH3-N removal in each reactor

圖9 Alpha多樣性指標箱式圖Fig.9 Alpha diversity indicator

2.3.3 群落結構穩定性與多樣性分析 在群落生態研究中，Alpha 多樣性指數可以反映微生物群落的豐度（richness）、均勻性（evenness）及多樣性等,在實際應用中微生物群落結構的穩定性直接影響到出水水質與處理效率。因此，選取Alpha 多樣性指數的四個指標Chao1、Simpson、Shannon 和Faith’s PD來計算物種豐度與多樣性。

如圖9 所示，Alpha 多樣性的四個指標在B 反應器中數值均大于A、C 反應器。Chao1 常用來估算物種總數，Simpson 則既考慮了物種的豐度也考慮了均勻性，Shannon 可估算物種多樣性，Faith’s PD 用來表示系統發育的多樣性[37]。由此結果可知，B 反應器中菌群豐度與多樣性都較高，且數量分布均勻，發育可變性較大，其系統穩定性高，抵抗外界不利條件能力強，與B 反應器對污染物去除效果較好的理化結果相吻合。

3 結 論

（1）在低溫環境下，各反應器COD 出水濃度均達到50 mg/L 以下，高通量測序結果顯示，在5℃時與去除COD 相關的菌種豐度高，種類多，屬于優勢菌。其中Saprospiracea與Sphingomonas可適應低溫環境正常代謝，且相關菌種總量在三個反應器中差異不大。

（2）經過逐步降溫過程的馴化后，裝有自制填料的B反應器在低溫下對氨氮的去除效果優于A和C 反應器，5℃時，B 反應器出水氨氮濃度為3.79 mg/L，A、C 反應器的出水氨氮平均濃度均為14.1 mg/L。說明該填料優于普通商用填料和另一自制填料。對于污水處理廠使用填料的改善和優化具有較大意義。

（3）B 反應器的填料在低溫條件下馴化富集了低溫硝化菌CandidatusNitrotoga，其他常見硝化菌豐度也高于A 和C 反應器，且不利于氨氮去除的類固氮菌Elstera在B 反應器中豐度最低，微生物群落結構穩定性優于A 和C 反應器，高通量測序結果與理化指標相吻合。

（4）在溫度降低的過程中，污水處理中常見的微型動物隨著溫度的降低逐漸減少，10℃時幾乎消失，線蟲的數量相比下降緩慢，5℃時仍有少量存活。