一株紅假單胞菌的分離及生理特性研究

田瑩瑩 吳幸強 姬燕培 馮秀芳 肖邦定

(1. 中國科學院水生生物研究所 中國科學院藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072;2. 河南工學院材料科學與工程學院, 新鄉 453003)

不產氧光合細菌(Anoxygenic Phototrophic Bacteria, AnPB)分布廣泛[1,2], 在碳、氮、磷等元素的地球生物化學循環過程中扮演著重要的角色[3,4]。在水生態系統中, 不產氧的紫色非硫光合細菌(Purple Nonsulfur Bacteria, PNSB)可見于藍藻形成的微生物墊及沉積物表層[5]。因其靈活多樣的代謝模式, PNSB常被應用于有機廢水處理和水體凈化過程[6—8]。此外, PNSB, 尤其是紅假單胞菌屬(Rhodopseudonassp.)光合細菌, 在生物制氫及土壤生態修復等過程均可起到顯著作用[9,10]。開展特定生境中光合細菌的分離鑒定及生理特性研究工作,對提高光合細菌污染凈化能力認識, 挖掘光合細菌潛在應用價值具有重要的意義。

不產氧光合細菌都使用某種形式的細菌葉綠素(Bacteriochloroghyll, Bchl)作為其主要的光合色素, 且只有唯一的細菌葉綠素-蛋白質反應中心(RC-1或RC-2)[11,12]。與高等植物有兩個獨立的光反應系統(Photosynthetic system, PS)不同的是,PNSB光反應中心只有一個(RC-2), 結構類似于高等植物光合系統Ⅱ(PS Ⅱ)[13]。調制葉綠素熒光(Pulse-Amplitude-Modulation, PAM)具有測量快速、簡單、可靠的特點, 且測量過程對樣品生長基本無影響, 是研究光合作用的強大工具[14,15], 對實現光合細菌生理指標的快速監測具有重要意義。目前已有學者利用調制葉綠素熒光研究RC-2型不產氧光合細菌光合反應器中能量和電子傳遞過程[16—18]。

本研究從武漢東湖沉積物中分離得到1株紫色非硫光合細菌, 對其細菌形態、特征吸收光譜、系統發育信息、蛋白質含量、ATP酶(ATPase)活性、光合作用及適宜生長條件等生理特性進行了研究,旨在提高人們對光合細菌的認識, 并為調制葉綠素熒光技術用于光合細菌生理特性表征提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

采集東湖表層沉積物樣品。移取適量靜置沉淀后的上清液至250 mL碘量瓶, 加入ATYP光合細菌富集培養基進行富集。ATYP富集培養基購于山東拓普生物工程有限公司。富集過程中瓶口用水密封。于光照強度1000 lx, 28℃恒溫培養。待培養物呈現明顯的紅色, 進行后續分離純化。

1.2 分離純化

采用雙層平板法分離光合細菌, 所用分離培養基為含1.5%瓊脂的上述富集培養基。將富集培養后的菌懸液梯度稀釋后均勻涂布于固體培養基表面。待涂布液被吸收后在其上傾倒一層同體積的固體瓊脂培養基。將制好的平板置于透光度較好的抽真空的干燥器中培養1—2周(1000 lx, 28℃)。用牙簽挑取兩層瓊脂間紅色菌落, 反復涂布、劃線、分離, 至鏡檢無雜菌且整個培養基表面為單一形態菌落, 得到供試菌株, 命名為PUF1。

1.3 光合細菌種子液的制備

用滅菌的牙簽挑取平板上的單菌落, 轉入裝有2 mL ATYP液體培養基的血清瓶中預培養, 后逐級放大培養至100 mL。于28℃、光照強度1000 lx下培養。

1.4 菌株鑒定

細菌分子鑒定所獲得的純菌株的分子鑒定通過擴增紫色非硫光合細菌光反應中心蛋白M亞基編碼的puf M基因進行, 所用特異性引物對為puf M 557F/750R[19]。取2 mL純培養菌懸液, 離心收集菌體沉淀, 用細菌DNA提取試劑盒(OMEGA Bio-Tek)提取細菌總DNA, 提取步驟按說明書進行。PCR反應體系(20 μL): 2×TaqMasterMix(CWBIO)10 μL, 無菌水8.5 μL, 引物各0.5 μL(10 pmol), DNA模板 0.5 μL。擴增條件: 94℃ 3min, 94℃ 30s; 59℃30s; 72℃ 1min; 39個循環; 72℃ 7min。將純化后PCR產物連接至pMD-18T載體, 進一步轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。隨機選取正確插入片段的陽性重組克隆, 送測序公司測序。所得基因序列采用BioEdit軟件進行組裝, 去除載體序列, 同時上傳序列至GenBank數據庫, 獲得登錄號(KU886140)。將測序得到的序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)網站上進行BLAST比對, 下載與其相似序列, 應用BioEdit中的ClustalW Multiple aligment程序進行多序列聯配, 用MEGA 5.1構建系統發育樹。

吸收光譜的測定取適量體積的對數生長期菌懸液兩份, 離心去除培養液, 一份用60%蔗糖溶液重懸后進行活細胞吸收光譜全波長掃描, 另一份用100%甲醇提取菌體色素, 取離心上清液進行色素吸收光譜全波長掃描(Cary WinUV, 安捷倫, 美國)。波長為200—1000 nm, 掃描速度為600 nm/min。

掃描電鏡觀察預先在光合細菌培養裝置中放入0.5 cm×0.5 cm玻璃片, 待細菌生長至穩定期取出。用0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液清洗玻片兩次, 后用2.5%戊二醛固定液固定2h。在固定液清洗后, 進行脫水, 脫水梯度為50%乙醇10min, 70%乙醇15min, 80%乙醇15min, 90%乙醇15min, 無水乙醇15min(兩次), 2:1乙醇-叔丁醇15min, 1:1乙醇-叔丁醇15min, 叔丁醇15min(兩次)。真空冷凍干燥后,取出玻片, 黏附于導電膠上, 上機(S-4800, Hitachi,日本)觀察。

透射電鏡觀察透射電鏡(HT-7700, Hitachi,日本)用于觀察PUF1超微結構。樣品前處理過程包括包埋塊的制備、包埋塊的修整及超薄切片制備,由中國科學院水生生物研究所分析測試中心負責完成。

1.5 細菌生物量測定

將新接種的細菌培養體系暗適應2h后, 于連續光照(1000 lx)、室溫(28±1)℃培養。定期取樣, 于波長650 nm測定培養液吸光度(A650)。細菌生長曲線用Logistic模型擬合:

式中a值為Amax,xc為到達生長曲線拐點處(即1/2a值)的時間,k為特定生長速率(/h)。

1.6 溶解氧、pH、光照強度的測定

培養液中溶解氧(DO)用微電極測定(Unisense,丹麥)。使用前用75%酒精沖洗溶解氧玻璃電極兩次。步距為0.5 mm, 測定體系中DO的垂直變化情況。

用1 mol/L HCl或NaOH調節pH至6.00、6.64、7.30和8.00, 觀察PUF1在不同pH條件下生長狀態。pH的測定用pH計(YSI pH 100A, 美國)。

光照強度梯度設置為: 100(室內自然光)、500、1000和3000 lx。光照強度用照度計測定(ZDS-10F-2D, 上海市嘉定學聯儀表廠, 中國)

1.7 元素組成分析

取冷凍干燥的生長穩定期細菌菌粉用于元素組成分析。細菌碳(C)、氮(N)含量的測定用元素分析儀完成(Vario EL cube, Elementar, 德國)。菌體含磷(P)量采用過硫酸鉀消解, 鉬藍比色法。細菌粗灰分(Ash)的測定采用灼燒法。

1.8 蛋白質含量及ATP酶活性測定

取適量體積光合細菌菌懸液, 高速離心(10000×g, 10min), 盡棄上清液, 用0.85%生理鹽水反復洗滌菌體沉淀多次。半微量凱氏定氮法測定蛋白質含量。

制備適宜濃度的細胞懸液(107/mL), 用超聲粉碎器破碎(冰浴), 搖勻后用于ATP酶(ATPase)活性的測定。ATPase活性的測定采用南京建成細胞微量ATP酶試劑盒進行。

測定細菌蛋白質、ATPase活性的同時, 取樣測定650 nm處培養液吸光度A650。

1.9 光合作用測定

用水樣調制葉綠素熒光儀(Water-PAM, WALZ,德國)測定純培養條件下PUF1光合作用。調節增益(Gain)使瞬時穩態熒光(Ft)在200至600之間變化, 測定PS II最大光量子產量(Fv/Fm)。測定快速光曲線時, 預先暗適應15min。光強度梯度為221、327、499、746、1058、1469、2410和3516 μmol photons/(m2·s), 兩步間隔15s, 光飽和脈沖在3000 μmol photons/(m2·s), 得到最大光利用系數(alpha)及最大電子傳遞速率(ETRm)。

1.10 數據分析

用Excel整理數據, 采用Origin 8.0作圖。用SPSS 19.0軟件進行統計分析。顯著性水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 光合細菌鑒定

菌落的形態特征平板計數PUF1時發現,生長于培養基表面的菌落周圍呈乳白色, 且菌落個體較大, 而位于兩層固體瓊脂之間菌落相對較小,通體呈紫紅色(圖 1)。

圖 2為光合細菌掃描電鏡圖, 可以看出光合細菌呈直的或稍彎曲的桿狀, 或成簇或零散分布于玻璃載體表面。生長穩定期PUF1大小為長3.05—10.06 μm,直徑0.32—0.68 μm。

圖 3為透射電鏡下光合細菌細胞超微結構圖,表明光合細菌具有明顯的片層膜結構。序列比對結果顯示PUF1與R.palustris的相似性最高, 推測所分離PUF1為紅假單胞菌屬的沼澤紅假單胞菌, 下載與其相似序列, 構建系統發育進化樹(圖 4)。

光合細菌掃描光譜細菌懸液掃描譜圖結果顯示, PUF1在波長377、460、490、592、807、865和980 nm處有較明顯吸收峰(圖 5A), 其中377、807和865 nm是細菌葉綠素a(Bchla)特征吸收峰,592和980 nm是細菌葉綠素b(Bchlb)的特征吸峰。PUF1菌體甲醇提取物呈青色, 波長460至540 nm處三個連續吸收峰是由類胡蘿卜素引起的, 波長771 nm處特征吸收峰由Bchla引起(圖 5B)。

在PUF1培養過程中血清瓶上部為少量無菌空氣, 依靠微生物自身生命活動消耗溶液中的氧(DO)。實驗過程中測定了不同培養時間(3d、4d和7d)體系中DO的垂直變化情況。結果顯示, 培養過程中有氧層厚度在0.5 cm; 液面下0.5至1 cm為缺氧-厭氧過渡階段, DO小于0.5 mg/L; 液面以下1 cm,培養體系完全厭氧(圖 6)。

2.2 元素組成

穩定期PUF1菌體C、N、P元素含量如表 1所示。除去灰分部分, PUF1菌體C、N相對含量分別為53.75%和10.35%, C/N摩爾比為6.06。

圖 1 平板計數PUF1Fig. 1 Colony enumeration of PUF1

圖 2 PUF1掃描電鏡圖Fig. 2 The scanning electron microscopic image of PUF1

圖 3 PUF1透射電鏡圖Fig. 3 The transmission electron microscopic image of PUF1

2.3 培養條件對光合細菌生長和光合作用的影響

pH對光合細菌生長和光合作用的影響微生物活動是由一系列酶促反應參與完成的, 維持pH在適宜范圍對細菌生長有重要意義。如圖 7所示, PUF1生長延遲期為12h, 5—6d達生長穩定期。PUF1生長曲線適用Logistic模型(R2≥0.97)。初始pH 6.00—8.00, 穩定期細菌生物量無顯著差異。初始pH 6.64, PUF1生長速率最快(k, 0.064/h), 生長周期最短(xc, 49.59h)。pH偏酸(pH 6.00)或偏堿(pH 8.00), PUF1生長速率較慢(k, 0.051/hvs. 0.041/h)。pH 8.0時PUF1生物量較高(A650, 1.38), 這可能與PUF1初始接種濃度稍高有關。

圖 4 菌株PUF1與相關菌株的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Strain PUF1 and related strains

圖 5 PUF1細菌懸液及甲醇提取物吸收光譜圖(A. 細菌懸液; B.甲醇提取物)Fig. 5 Absorption spectra of the intact cell suspension (A) and methanol extract (B) of strain PUF1

此外, 實驗考察了不同初始pH培養條件下PUF1光合作用參數的變化(圖 8)。實驗6d, 各處理組Fv/Fm與pH分別為: 初始pH 6.00,Fv/Fm0.10(pH 7.72±0.33), 初始pH 6.64,Fv/Fm0.12(pH 7.95±0.28),初始pH 7.30,Fv/Fm0.08(pH 8.39±0.21)。由圖 8D可知, 初始pH 8.00, 實驗2d,Fv/Fm為0(pH 8.4), 光合活性下降顯著。由圖 8B和圖 8C也可看出, 實驗3d初始pH 6.64升高至8.03, 初始pH 7.30升高至8.32,此條件下Fv/Fm、α顯著降低。以上結果表明, 培養體系pH高于8.00或對PUF1光合作用有顯著抑制。

圖 6 不同培養時間溶解氧的垂直變化Fig. 6 The vertical profile of dissolved oxygen at different culture times

表 1 菌株PUF1主要元素含量Tab. 1 Proportion of major elements of strain PUF1

圖 7 不同初始pH條件下PUF1生長曲線Fig. 7 The growth curve of PUF1 from different initial pH

光照強度對光合細菌生長和光合作用的影響如圖 9所示, 光照強度500—3000 lx(初始pH 6.8), 穩定期細菌生物量無顯著差異, 其中光照強度3000 lx, 細菌生長速率最快(k, 0.059/h), 生長周期最短(xc, 59.30h)。當光照強度為100 lx時, 細菌增長緩慢。

實驗結束, 在四組光照強度下, 培養體系pH均小于8.0。光照強度500—3000 lx,Fv/Fm變化規律為遲滯期較低, 對數期較高, 穩定期降低; 光照強度100 lx,Fv/Fm在培養初期(0—60h)稍有下降, 后呈直線上升趨勢, 實驗結束時Fv/Fm較高(0.17±0.02, 圖 10),這可能與體系內較少的細菌生物量和充足的剩余營養物有關。

2.4 光合細菌生長周期內蛋白質、ATP酶及光合活性的變化

光合細菌蛋白含量與ATP酶活性如圖 11所示, PUF1菌體蛋白含量在細菌生長不同階段有所差異, 表現為適應期含量低, 對數至穩定期含量較穩定且顯著高于適應期蛋白含量(P＜0.05)。穩定期PUF1蛋白質含量為(634.09±4.3) mg/g, 超過菌體干重的60%, 可作為優質的單細胞蛋白來源。ATPase存在于組織細胞及細胞器的膜上, 是生物膜上的一種蛋白酶, 參與物質運輸、能量轉換以及信息傳遞等, 機體在脅迫狀態下, 此酶活力發生一系列改變。ATPase活性隨培養時間的延長而下降, 推斷培養后期可能由于碳源、維生素等營養物質缺乏和細胞老化導致細胞ATPase活性下降顯著。

PUF1光合活性通過對Fv/Fm的監測可在一定程度上反映PUF1的生長狀態, 為光合細菌的規模化培養提供可行性指導。如圖 12所示, 在PUF1生長周期內Fv/Fm的變化規律符合單峰高斯模型(Gauss model), 拐點處A值為0.65(即1/2Amax), 表明對數期Fv/Fm最高, 而遲滯期與穩定期Fv/Fm均相對較低。造成以上結果的原因, 主要可以歸納為以下兩部分。首先, 與培養體系中物質的轉化與利用有關, 主要為初期細菌需要適應新的培養條件, 而穩定期細菌生物可利用營養物質(如碳源)短缺使得PUF1光合作用受影響。此外, 光能利用率的降低也是不可忽略的因素, 一方面, PUF1貼壁生長, 影響反應器透光性, 另一方面, 穩定期PUF1生物量高,細菌相互遮擋, 都會影響光能的可利用性。應用調制葉綠素熒光技術對RC-2型光合細菌資源開發及其快速監測具有重要意義, 值得深入研究。

圖 8 光合作用參數與pH關系Fig. 8 Relationship of pH and photosynthesis parameters

3 討論

3.1 光合細菌的分離及特性

本研究利用雙層平板法, 從武漢東湖分離篩選出一株不產氧光合細菌, 所分離光合細菌與Ramana等[20]對紅假單胞菌屬光合細菌形態的觀察結果基本一致, 且具有明顯的片層膜結構, 與沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris,R. palustris)WKUKDNS3細胞超微結構[21]高度相似?；赑UF1光反應中心puf M功能基因片段測序結果, 發現該菌株與沼澤紅假單胞菌親緣關系最近, 初步確定為紅假單胞菌屬紫色非硫光合細菌, 命名為Rhodopseudo-monas palustrisstrain PUF1。菌株PUF1特征吸收譜圖掃描結果與Okubo等[22]對豬場廢水溝渠光合細菌微生物墊的研究結果一致。菌株PUF1不同生長階段其蛋白含量有所差異, 以穩定期為最高, 可達細胞干重的60%, 是優質的單細胞蛋白。Carlozzi等[23]對R. palustris元素組成進行了分析, 得出R. palustris元素組成為CH1.92N0.17O0.41(不考慮灰分部分)。在本研究中菌株PUF1 C、N元素含量與Carlozzi等[23]研究結果大體相當。PUF1具有代謝藍藻生物質的潛力, 以野外藍藻為培養基質, 干藻粉濃度1.67 g/L可顯著促進PUF1增殖, 并可實現對體系內氮、磷營養物質的再利用[24]。PUF1與其同源菌株R.palustrisTIE-1相似性為99%, 其中TIE-1具有從富含鐵、硫及其他礦物質的沉積物中獲得電子的特性, 因而可將TIE-1用于電池生產過程[25], 而PUF1是否也同樣具備發電能力需進一步研究。

圖 9 不同光照強度下PUF1生長曲線Fig. 9 The growth curve of PUF1 from different light intensity

圖 10 光合作用參數與光照強度Fig. 10 Relationship of light intensity and photosynthesis parameters

紫色非硫光合細菌(PNSB), 尤其是紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonassp.)光合細菌分布廣泛, 代謝模式靈活, 對多種有機物降解作用顯著[7,10,22], 是生物制氫、黑臭水及水體富營養化治理等領域中重要的候選微生物[8,9,24]。Okubo等[22]利用固體平板涂布和厭氧產氣袋結合的方法對豬場廢水溝渠中的PNSB進行了分離, 發現紅細菌屬和紅假單胞菌屬占優勢。Sharma等[21]利用同種分離方法, 從夏季設施豬場瀉湖樣品中分離得到一株沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustrisWKU-KDNS3, 好氧條件下能降解污水塘中廣泛存在的3-甲基吲哚惡臭物質。尹樂斌等[26]利用雙層平板法從農藥廠污水處理池分離得到一株高效降解氯氰菊酯農藥的沼澤紅假單胞菌PSB07-13, 培養6d, 對50 mg/L氯氰菊酯的降解率可達80%。以上研究結果表明R.palustris在生態系統中可發揮廣泛的作用, 提高了人們對PNSB代謝多樣性的認識。因此, 針對特定污染水域光合細菌的分離對后期水治理工作可發揮重要的適用性和實用性價值, 需深入研究。

3.2 環境因素對光合細菌的影響

靜水水體中低濃度的溶氧和簡單有機質的存在是導致PNSB驟增的重要因子[22]。對DO監測結果表明, 采用ATYP培養基可為PUF1生長營造良好溶氧環境。有研究指出在振蕩培養條件下, PNSB色素合成能力喪失或降低, 培養物呈灰白色或微粉紅色[27], 細胞無增殖[28]或雖能生長, 但生長量明顯低于靜止、微氧條件下的生長量[27,29]。但DO對色素合成的脅迫作用是可逆的, 氧脅迫作用去除, 光合細菌又可恢復合成色素的能力。

圖 11 PUF1蛋白質含量與ATPase活性的動態變化Fig. 11 The dynamics of protein contents and ATPase activities of strain PUF1

圖 12 PUF1培養周期內Fv/Fm變化Fig. 12 The variations of Fv/Fm in the whole culture period of PUF1

Choorit等[29]研究了Rhodopseudomonas palustrisKG31在乙酸、丙酸、丁酸及混合碳源培養條件下生長情況, 結果顯示, 在光照、微需氧條件下KG31生長遲滯期為7.29—12.49h, 最大生長速率為0.038—0.094/h。培養基pH低于5或等于10光合細菌均難以生長, 且在不同培養基中其最適pH范圍有所不同[27]。

已有研究表明, pH對光合作用有顯著影響。錐狀斯氏藻和塔瑪亞歷山大藻對pH的變化及其敏感,適宜pH為7.0—9.0, pH高于9.5時, 不能進行有效的光合作用[30]。隨著pH的升高, 金魚藻Fv/Fm與ETR相應上升, pH高于10或低于7則均下降[31]。張虎等[32]研究了pH對小球藻光合作用、生長和產油的影響, 發現pH為7.0—9.0, 光合放氧、生長速率、生物質產率、總酯含量和產率均保持在較高水平,而pH低于7.0或高于9.0, 上述指標都顯著降低。Adessi等[16]研究了室外培養條件下R.palustris產氫與Fv/Fm關系, 結果顯示產氫階段Fv/Fm變化不顯著,在培養初期Fv/Fm維持在較低水平, 推測因需適應室外高光條件導致。本研究利用Water-PAM測定了培養周期內PUF1光合作用變化規律, 發現Fv/Fm在細菌生長對數期較高, 而延遲期較低, 與上述研究結果一致。在室外培養條件下, 光照充足,Fv/Fm較高(0.55—0.65)[16], 而室內培養光照較弱(100—3000 lx), 可能是導致Fv/Fm較低(小于等于0.3)的主要原因。pH在較小的范圍內變化(pH 6.00—8.00)對細菌光合作用影響不明顯, 而當培養體系pH高于8.00,Fv/Fm降低顯著, 因此PUF1規?；囵B過程中應加強對pH的動態監測。此外, 室外高光條件下,R.palustris培養過程中Fv/Fm較高, 為0.55—0.65, 這可能與充足的光補償有關。

光合細菌應用前景廣闊, 快速監測技術的開發在其規?；囵B過程中意義重大。目前, 有關pH對光合細菌光合作用的影響機制尚不清楚, 深入研究Fv/Fm、ATPase、蛋白質等細菌生理生化指標與培養體系中營養物質利用的關系, 對全面和快速評估細菌生長具有重要意義。