甘薯新品種莖尖培養及病毒檢測技術

許泳清 李華偉 邱永祥 林趙淼 張鴻 李國良 邱思鑫

摘 要：為了優化甘薯莖尖培養方法，獲得甘薯新品種脫毒試管苗。采用正交試驗法，研究NAA、GA3和6BA三種因素對甘薯莖尖分化和植株再生的影響，篩選培養基最佳配方;在正交試驗基礎上，進一步考察不同甘薯品種在最佳培養基組合的莖尖分化和植株再生情況;并用RTPCR方法對成苗的甘薯品種再生株系進行病毒病（SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV）檢測。結果表明：各試驗因素對福薯604莖尖分化成苗影響的主次關系為6BA>NAA>GA3，福薯604莖尖組培成苗的最佳組合為MS培養基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+

GA3 0.1 mg·L-1，其莖尖組培苗萌芽率為93.3%、成苗率達50.0%。不同甘薯品種在最佳培養基組合條件下的莖尖分化情況表現不同，其中，福菜薯23和福薯116甘薯品種的莖尖分化和植株再生情況最好。不同甘薯品種試管苗經RTPCR檢測，最終獲得福薯8號、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯16號、福薯33和福薯113等12份甘薯脫毒試管苗，可應用于實際生產。

關鍵詞：甘薯;莖尖脫毒;RTPCR;病毒檢測

中圖分類號：S531 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2020）12-0052-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.010

Techniques of Stem Tip Culture and Virus Detection of New Sweet Potato Varieties

XU Yongqing， LI Huawei， QIU Yongxiang， LIN Zhaomiao， ZHANG Hong， LI Guoliang， QIU Sixin

（Institute of Crop Sciences， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observation and Experiment

Station of Tubers in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Fujian Engineering Research Center

for Characteristic Dry Crop Variety Breeding， Fuzhou， Fujian 350013， China）

Abstract： In order to optimize the culture method of the stem tips of sweet potato， and obtain the virusfree testtube plantlet of the new sweet potato variety， the effects of NAA， GA3 and

6BA on the differentiation of stem tips and plant regeneration of sweet potato were studied by orthogonal experiment， and then the best formula of the medium was selected. Based on the orthogonal experiment， the differentiation of stem tips and plant regeneration of different sweet potato varieties in the optimal combination of medium were further investigated， and the method of RTPCR was used to detect the virus diseases （SPFMV， SPCSV， SPVG， SPVC and SPLV） in the regenerated lines of sweet potato varieties after they became seedling. The results showed that the effects of various experimental factors on the differentiation of stem tips and plant regeneration of Fushu 604 were ordered as follows： 6BA， NAA and GA3. The optimal medium combination for the stemtip tissue culture seedling of Fushu 604 was MS medium +6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L-1. The germination rate and seedling rate of the stemtip tissue culture seedling were 93.3% and 50.0%， respectively. Different varieties of sweet potato showed different differentiation of stem tips under the optimal medium combination， among which the varieties of Fucaishu 23 and Fushu 116 showed the best differentiation of stem tips and plant regeneration. The testtube plantlets of different varieties of sweet potato were detected by RTPCR， and then 12 virusfree testtube plantlets of sweet potato were obtained， including Fushu No.8， Fushu 34， Fucaishu 22， Fushu 916， Fushu 90， Fucaishu 23， Fushu 116， Fushu 317， Fushu 604， Fushu No.16， Fushu 33 and Fushu 113， which could be used in the actual production.

Key words： Sweet potato; Virusfree stem tip; RTPCR; Virus detection

甘薯Ipomoea batatas L.Lam是我國第四大糧食作物，據統計2017年全國甘薯種植面積約337.3萬hm2[1]。甘薯以其產量高、抗逆性強和適應性廣等特點在20世紀60～70年代被廣泛種植，曾作為“救命薯”救活了一代人[2]。福建省作為我國甘薯的最早引入地，種植甘薯有400多年的歷史。福建省農業科學院作物研究所薯類課題組從1978年以來就開始進行甘薯育種研究工作，先后選育出了福薯87、福薯2號、福薯7-6、福菜薯18號等優良品種。近年來，由于全國各地種苗調運頻繁，造成福建省甘薯病毒病愈發嚴重。生產上流行的甘薯病毒病種類主要有SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV等5種[3]，其中由SPCSV和SPFMV協生共侵染甘薯引起的病害為甘薯病毒病害（sweetpotato virus diseases，SPVD）[4]，SPVD是甘薯上的毀滅性病害，已成為影響甘薯的最重要病毒病之一，甘薯一旦受侵染，嚴重影響產量，甚至絕收。目前還沒有特效藥能夠防治甘薯病毒病，培育抗病品種和種植健康種苗是最根本的途徑，由于缺少廣譜抗性的種質資源加上病毒自身的變異，給抗病品種的選育帶來困難，所以培育健康種苗顯得尤為重要。目前健康種苗的獲得是通過莖尖脫毒培養才能獲取脫毒試管苗，莖尖的成苗率和病毒檢測技術越顯重要。本試驗通過篩選適宜的莖尖分化培養基，以提高莖尖成苗率，用RTPCR法檢測試管苗，以期快速獲得甘薯新品種的脫毒試管苗，為生產奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2018-2019年在福建省農業科學院作物研究所埔垱實驗室進行。供試甘薯品種材料為福薯604、福薯90、福薯8號、福薯317、福菜薯23號、福菜薯22號等14個甘薯新品種（表1），均是本課題組通過雜交選育出的新品種。

1.2 不同激素對誘導甘薯莖尖分化和成苗的影響

莖尖誘導培養基采用三因素四水平L16（43）正交試驗設計（表2），以MS為基礎培養基，NAA、6BA、GA3為試驗因素，代號分別為A、B、C，各因素取4個水平，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，分裝于21 mm×100 mm的試管中，121℃高壓滅菌20 min后備用。

供試品種為福薯604。取大棚生長健壯的甘薯莖尖或薯塊發芽的莖尖（約2 cm長），剪去大葉，用流水沖洗干凈，置于超凈工作臺上進行消毒滅菌。先用75%乙醇消毒20 s，滅菌水沖洗5次，接著用0.1%升汞消毒2～3 min，滅菌水沖洗5次，放置于無菌濾紙上吸干水分，備用。在40×解剖鏡下，剝去小葉片，切取帶1～2個葉原基的生長點，迅速接種于配置好的試管培養基表面上，每個處理接30個莖尖，3次重復。

培養條件：在光照強度4000 lx，光照時間16 h·d-1，溫度25℃的培養箱中進行培養。其間觀察莖尖分化和植株再生情況，于60 d后統計成苗率（以形成2片展開葉片的植株為標準）。

1.3 不同甘薯品種莖尖分化和植株再生的形成

以MS為基礎培養基，添加植物生長激素萘乙酸（NAA，0.1 mg·L-1）、6芐氨基腺嘌呤（6BA，1.2 mg·L-1）、赤霉素（GA3，0.1 mg·L-1，過濾滅菌后加入），再加入30 g·L-1蔗糖，5 g·L-1瓊脂，分裝于21 mm×100 mm的試管中，121℃高壓滅菌20 min后備用。供試品種見表1，方法同1.2，每個品種接20個莖尖。

1.4 新成苗的甘薯試管苗主要病毒病檢測

1.4.1 病毒檢測引物 設計并合成了甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯退綠矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）、甘薯病毒C（SPVC）和甘薯潛隱病毒（SPLV）特異性檢測引物，引物由福州尚亞生物技術有限公司合成，引物序列見表3。

1.4.2 RNA提取及cDNA合成 植物RNA及cDNA合成參照試劑盒說明進行，RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.4.3 RTPCR檢測和PCR產物測序 PCR反應體系25 μL：取cDNA 2 μL，病毒的上、下游引物各0.5 μL，10 Mix μL，用ddH2O補足至總體積25 μL，混勻后離心。反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，56～58℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，循環30次;最后 72℃ 延伸10 min，4℃保存。

反應結束后，取5 μL的PCR擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓120 V，結束后將膠放置于凝膠成像儀上觀察拍照。將PCR產物送至福州尚亞生物工程有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 不同激素對誘導甘薯莖尖分化和成苗的影響

福薯604在不同處理的培養基中莖尖分化情況結果列于表4。從表4可以看出，6BA是影響成苗率的主要因素（R=19.325），其次是NAA（R=17.375），影響最小的因素是GA3（R=17.250）。根據各因素在不同水平成苗率的平均值（K1、K2、K3、K4），福薯604莖尖組培的最佳配方是MS+6BA（1.2 mg·L-1）+NAA（0.10 mg·L-1）+GA3（0.10 mg·L-1），萌芽率達93.3%，成苗率達50.0%。16個處理的莖尖組織都有萌動，處理13的萌芽率最低，為76.7%，處理2、3、5、6、11的萌芽率最高，達100.0%;處理12的愈傷組織分化率最高，達77.8%，處理1、2、3、4、5、9、13的愈傷組織分化率最低，均為0。

2.2 不同甘薯品種莖尖分化和植株再生情況

從表5可以看出，不同甘薯品種在MS培養基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L-1培養條件下的莖尖分化情況表現不同。其中，福菜薯23、福薯116和福薯604莖尖分化最好最快，接種后3 d就可以看見生長點明顯變大變綠，成苗率也高達25.6%，說明該培養基適宜以上3個甘薯品種的莖尖分化。福薯8號、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90接種10 d可見莖尖分化，膨大變淡黃色，但是莖尖基部多數形成淡黃色愈傷，導致成苗速度變慢，多數莖尖成苗時間在30 d以上。福薯317、福薯16號、福薯113、福薯33等品種莖尖分化較差，接種25 d后有些生長點出現褐化。福薯203和福薯404莖尖分化情況最差，接種后生長點分化緩慢，隨后變褐色干枯，未形成完整植株的莖尖，成苗率為0。

2.3 試管苗病毒檢測結果

以5種病毒的RNA作模板，用篩選出的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV引物進行RTPCR擴增，得到特異性條帶（圖1）。利用建立的RTPCR體系對成苗的甘薯品種再生株系進行病毒檢測，結果顯示，其中2份樣品中檢測出SPFMV、SPCSV和SPVG 3種病毒，未檢測出SPVC和SPLV，結果獲得12份脫毒甘薯品種試管苗，分別是福薯8號、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯113、福薯16號和福薯33。

3 結論與討論

本試驗結果表明，不同基因型甘薯品種在MS培養基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1mg·L-1培養條件下的莖尖分化和植株再生情況表現不同，福菜薯23、福薯116和福薯604莖尖分化速度很快，接種3 d后就可以看見生長點明顯膨大變綠，誘導培養14 d后接分化培養基，25 d后開始成苗，成苗率可達25.6%。福薯317、福薯16號、福薯113、福薯33等品種莖尖分化較慢，接種后慢慢膨大。福薯8號、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90等品種出現淡黃色愈傷，轉接分化培養基后，40 d才開始部分成苗，成苗率最高僅為13.8%。福薯203和福薯404分化差，大部分莖尖出現褐化，慢慢變干枯，最后沒有成苗的莖尖。這與不同品種莖尖內源激素種類和濃度有關，相關研究表明[5-9]只有通過添加外源激素，才能打破個體內源激素間的平衡，并且要有適當的濃度配比，才能使甘薯芽的分化和生長達到最佳點[10-11]。因此，針對不同基因型品種，必須篩選出適宜的激素濃度配比，才能提高成苗速度和成苗率。

培育脫毒苗是目前最為有效的防治甘薯病毒病的方法，在脫毒苗培育過程中需要對試管苗進行快速和準確的檢測，因此，建立能快速、準確地檢測病毒的PCR方法具有重要意義。本研究通過RTPCR檢測發現，成苗的12份甘薯品種株系的病毒感染率低。其中，僅福薯604的2個再生株系檢測出SPFMV、SPCSV和SPVG，其余株系均未檢測出。本研究獲得12份甘薯新品種的脫毒試管苗，分別為福薯8號、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯113、福薯16號和福薯33，可進行大量擴繁應用于生產。

試驗中關于影響甘薯莖尖分化誘導成苗除了本試驗中考慮的因素，其他培養因素有待進一步研究探討。本研究僅對誘導成苗的株系進行了病毒檢測，未開展對攜帶病毒植株脫毒效果的研究。下一步將研究如何提高甘薯試管苗脫毒率和再生率。

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（責任編輯：林玲娜）