家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變一家系LRP5基因突變和臨床表型分析

孫巖，王卓實，徐玲，王苗苗，何偉

（沈陽何氏眼科醫(yī)院遺傳門診，遼寧 沈陽 110033）

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變 （familial exudative vitreoretinopathy，F(xiàn)EVR）是一種臨床和遺傳上異質(zhì)性很強的一類疾病，它是由Criswick和Schepens［1］于1969年首次發(fā)現(xiàn)和提出的，此后國內(nèi)外對FEVR的研究逐漸深入。FEVR臨床異質(zhì)性表現(xiàn)可以從無任何癥狀到視網(wǎng)膜完全脫離，同一家庭的不同先證者之間也可能存在臨床癥狀差異，甚至單一先證者的雙眼表型也可能不同，這給疾病的診斷和干預(yù)帶來了很大的困難。該疾病的典型臨床表現(xiàn)是雙眼周邊視網(wǎng)膜的血管發(fā)育異常，伴有新生血管、視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜褶皺、玻璃體滲出、玻璃體和視網(wǎng)膜粘連等，發(fā)病嚴(yán)重者會導(dǎo)致失明［2-3］。根據(jù)臨床表現(xiàn)和眼底熒光血管造影（FFA）診斷，結(jié)合基因檢測，可以幫助輔助診斷FEVR，并了解整個家族的基因突變攜帶情況［4-5］。先前的研究發(fā)現(xiàn)FEVR具有多種遺傳模式，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳［6］，其中常染色體顯性遺傳是FEVR中最常見的形式［7］。迄今為止發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD4、LRP5、KIF11、NDP、ZNF408基因均與 FEVR 有關(guān)［8-12］，其中FZD4、LRP5、KIF11基因遺傳模式是常染色體顯性遺傳，并在韓國人群中致病突變檢出率高，合計占比 35.3%，而LRP5基因突變占比5.6%［13］，但是LRP5基因在中國人群中報道的突變頻率較低。有研究發(fā)現(xiàn)LRP5基因參與Norrin信號蛋白分子介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路，該通路在組織發(fā)育和細(xì)胞分化中起著非常重要的作用，不僅參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、血管發(fā)育和胚胎發(fā)育，而且與血管生成密切相關(guān)［14］。Wnt/βcatenin信號通路在生物進(jìn)化中高度保守，并在許多生命活動中起著至關(guān)重要的作用，臨床上可以表現(xiàn)出胚胎眼底新生血管形成，這種病理變化是導(dǎo)致FEVR的主要原因［15］。基于遺傳因素在FEVR的發(fā)病機(jī)理中的重要影響因素，以及早期臨床確診的困難性，有必要尋找其他致病基因或致病突變，并深入研究FEVR的發(fā)病機(jī)理，為該類疾病的早期干預(yù)和臨床治療提供必要的研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 將2019年1月在沈陽何氏眼科醫(yī)院確診的1例FEVR先證者家系納入本研究，其中男1例，女3例。FEVR的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）眼底檢查顯示周邊視網(wǎng)膜無血管； （2）FFA顯示周邊視網(wǎng)膜無血管，可發(fā)現(xiàn)不同程度的視網(wǎng)膜下液或視網(wǎng)膜脫離；（3）無早產(chǎn)、低出生體重和吸氧史的兒童；（4）FEVR家族史； （5）排除Norrie病和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。先證者及其家系成員由同一名視網(wǎng)膜專家進(jìn)行評估［16］。排除標(biāo)準(zhǔn)： （1）不能配合完成相關(guān)檢查者； （2）無法判斷發(fā)病原因是由遺傳因素引起的； （3）無家系血樣可以進(jìn)行基因驗證者。本研究經(jīng)沈陽何氏眼科醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn) （批文號：IRB（2016）K001.01），所有先證者及其家系成員均簽署知情同意書。

1.2 獲取先證者和家系成員相關(guān)病史及進(jìn)行相關(guān)物理檢查 先證者和家系成員均通過標(biāo)準(zhǔn)眼科臨床檢查，以明確診斷，并排除其他非遺傳因素引起的眼部疾病。病史包括基礎(chǔ)個人信息 （包括性別、年齡、家庭情況、籍貫、民族等）、主訴、現(xiàn)病史 （發(fā)病情況、就診情況、用藥情況、并發(fā)癥種類和時間等）、既往史 （其他器官病變、基因檢測史等）、遺傳史、手術(shù)和藥物史、婚育史等。物理檢查包括視力檢查和矯正視力、非接觸性眼壓、B超 （天津邁達(dá)，型號 ODM-2200）、眼底照相（Topcon，型號TRC NW-300）、光相干斷層掃描（卡爾蔡司，型號Cirrus HD-OCT 5000）和眼底熒光造影 （海德堡，型號Spec-KT）檢查。

1.3 高通量二代基因測序

1.3.1 樣本采集 常規(guī)采集符合要求的先證者及家系成員肘部靜脈血5 ml，ETDA抗凝，-80℃保存。

1.3.2 靶向基因捕獲和變異解讀 （1）DNA提取：Qiagen試劑盒 （荷蘭Qiagen公司，型號Flexi-Gene）提取先證者及家系成員外周血的DNA，Qubit熒光儀 （賽默飛中國，型號Qubit 4）檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳儀 （賽默飛中國，型號Fastruler SM1103）檢測DNA完整性；（2）文庫制備：參考華大基因的BGISEQ-500的文庫構(gòu)建指導(dǎo)手冊進(jìn)行；（3）上機(jī)測序：質(zhì)控合格的文庫采用深圳華大基因股份有限公司BGISEQ-500 PE50＋10定制基因捕獲芯片的NGS程序上機(jī)測序，共檢測792個眼科目標(biāo)基因編碼外顯子、±3 bp的內(nèi)含子區(qū)域和非編碼區(qū)域 （UTR）［17］。按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)流程，通過PCR擴(kuò)增DNA片段，并與特殊設(shè)計的DNA捕獲探針雜交，將洗脫的DNA片段再次擴(kuò)增，并使用 Illumina HiSeq 2500 Platform（美國Illumina公司）測序系統(tǒng)進(jìn)行NGS檢測。

1.3.3 序列和生物信息學(xué)分析 從測序儀獲取原始數(shù)據(jù) （FASTQ數(shù)據(jù)），對原始FASTQ數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，利用BWA（BWAMEM，版本0.7.10）軟件，使用hg39人類參考基因組參考序列進(jìn)行比對，基于Picard去除重復(fù)序列，使用基因組分析工具套件 （GATK，版本3.3）對數(shù)據(jù)進(jìn)行突變檢測，使用頻率數(shù)據(jù)庫db-SNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫 （G1000）、ESP6500數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫以及BGI內(nèi)部數(shù)據(jù)庫進(jìn)行頻率注釋，去除次要等位基因頻率 （MAF）＞0.1%的變異位點；使用人類基因組變異協(xié)會 （HGVS）規(guī)則對突變進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)命名；使用OMIM、HGMD等疾病數(shù)據(jù)庫進(jìn)行突變及疾病注釋。

1.3.4 檢測結(jié)果解讀篩選候選基因致病變異（1）篩選、過濾：按照注釋標(biāo)準(zhǔn) （MAF≤0.05%，G1000、 dbSNP、 ESP6500、 ExAC≤0.01） 去除數(shù)據(jù)庫中正常人群攜帶頻率較高的非致病性突變，去除內(nèi)含子區(qū)、UTR區(qū)和基因間突變，去除同義突變等突變類型； （2）有害性評估：通過SIFT、PolyPhen等軟件預(yù)測，去除預(yù)測為良性或中性的突變，篩選出保守性強并且具有危害性的突變，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會 （ACMG）的標(biāo)準(zhǔn)和指南評估變異的有害性； （3）家系共分離驗證：通過家系樣本Sanger驗證，確認(rèn)致病基因突變在家系成員之間的遺傳方式和臨床表型對應(yīng)關(guān)系。 （4）致病性突變分類：致病性分類按照《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》提供的規(guī)范，使用特定標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語來描述，包括 “致病的”、 “可能致病的”、“臨床意義未明”、“可能良性的”和“良性的”。

1.3.5 Sanger驗證 利用Primer3設(shè)計所有聚合酶鏈反應(yīng)引物進(jìn)行驗證。本研究4例家系成員均進(jìn)行Sanger測序，用于驗證所鑒定的突變，并通過家系共分離驗證。

2 結(jié)果

2.1 測序質(zhì)量結(jié)果 該家系目標(biāo)序列平均測序深度為112.47，目標(biāo)序列覆蓋率平均99.94%。平均99.98%的目標(biāo)序列覆蓋率＞10×，平均97.91%的目標(biāo)序列覆蓋率＞30×，測序深度和平均覆蓋率均符合檢測要求。

2.2 家系臨床表型情況 本研究4例家庭成員中FEVR患者3例，正常表型家系成員1例，見圖1。罹患FEVR的3例家系成員最佳矯正視力均低于指數(shù)視力，且均于出生時發(fā)現(xiàn)特征性臨床表征，其中先證者及其姐姐和父親分別同時伴發(fā)右眼牽拉性視網(wǎng)膜脫離、永存原始玻璃體增生癥 （persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV）和核性白內(nèi)障，見表1。全視野眼底照相和FFA檢查顯示先證者的臨床表型符合FEVR特征，但先證者姐姐和父親因為并發(fā)雙眼眼球震顫和核性白內(nèi)障，僅留取部分眼底照相。先證者FFA表現(xiàn)為雙眼周邊視網(wǎng)膜血管分支增多，分布密集，呈現(xiàn)典型的“柳枝”樣形態(tài)，伴顳側(cè)牽引性視網(wǎng)膜脫離和視網(wǎng)膜內(nèi)/下滲出，伴鐮狀視網(wǎng)膜固定褶皺。但是因同一基因突變致病的先證者姐姐卻出現(xiàn)左眼PHPV，表現(xiàn)為后極部視網(wǎng)膜表面一灰白色條索樣增殖膜自視盤處向顳上方周邊視網(wǎng)膜延續(xù)，增殖膜下方視網(wǎng)膜表現(xiàn)出脫色素，伴視網(wǎng)膜色素上皮層萎縮及色素團(tuán)塊析出。先證者父親因為雙眼核性白內(nèi)障，無法獲得清晰的眼底檢查報告。先證者母親眼底表現(xiàn)正常，未發(fā)現(xiàn)周邊視網(wǎng)膜血管滲漏和新生血管增殖。見圖2、圖3。

圖1 FEVR先證者家系圖及基因攜帶情況

圖2 家系眼底照相圖

2.3 基因檢出情況 本研究發(fā)現(xiàn)了LRP5基因的一個未報道的缺失突變c.2013delC，該突變位于LRP5基因的9號外顯子，呈常染色體顯性遺傳，通過家系共分離和Sanger驗證，被確認(rèn)為該家系FEVR的疑似致病突變，見圖4。

表1 FEVR家系臨床信息

圖3 先證者FFA圖

3 討論

FEVR是一類遺傳和臨床異質(zhì)性非常強的遺傳眼病，主要表現(xiàn)為周邊視網(wǎng)膜新生血管和纖維膜增殖。患者可能在發(fā)病早期無明顯的癥狀和體征，而在后期可能出現(xiàn)嚴(yán)重的玻璃體出血和牽拉性視網(wǎng)膜脫離，導(dǎo)致視力下降甚至失明。本研究收集的FEVR家系被檢出來自于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 （LRP5） 的基因突變。Toomes等［18］在一顯性遺傳的FEVR家系中發(fā)現(xiàn)了LRP5基因突變，后續(xù)又有其他研究證實了FEVR家系的LRP5突變［19-20］。LRP5基因定位于人染色體 11q13.4，全長136.6 kb［21］，LRP5跨膜蛋白能與FZD4基因編碼的Frizzled4蛋白形成受體復(fù)合物，參與活化Wnt/β-catenin信號通路。LRP5基因突變最初是在患有隱性遺傳的骨質(zhì)疏松伴假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征 （osteoporosis pseudoglioma syndrome， OPPG）的患者中發(fā)現(xiàn)［22］，目前認(rèn)為該病與FEVR是同一種疾病，該病的典型特征是兒童骨質(zhì)疏松和FEVR的眼部表現(xiàn)。主要致病機(jī)制可能是由于LRP5基因不僅參與視網(wǎng)膜血管發(fā)育，還在嗜鉻樣細(xì)胞中通過抑制血清素的合成來促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨形成中起到作用，導(dǎo)致了大多數(shù)OPPG患者出現(xiàn)嚴(yán)重的雙側(cè)視網(wǎng)膜發(fā)育不良或先天盲，同時伴有骨密度明顯減低。

圖4 家系Sanger驗證結(jié)果

本研究首次報道了LRP5基因的一個未報道的缺失突變c.2013delC，該突變位于LRP5基因的9號外顯子中，呈常染色體顯性遺傳，該缺失移碼突變引起閱讀框變化，使編碼蛋白質(zhì)從突變位點開始氨基酸序列發(fā)生改變，導(dǎo)致LRP5基因分別在突變位點后的第26個氨基酸位置發(fā)生截短終止，進(jìn)而損害編碼蛋白質(zhì)的功能。通過UCSC（http：//genome.ucsc.edu/）在線工具對突變位點的氨基酸進(jìn)行保守性分析，顯示c.2013delC突變位點在人類、恒河猴、小鼠、狗、大象、家雞等脊椎動物中相對保守，提示這些突變對LRP5基因功能可能會造成嚴(yán)重影響。

FEVR的早期診斷決定了疾病的預(yù)后，由于新生血管形成對視覺結(jié)果的影響，早期診斷可以保持更好的視力。目前主流的診斷主要依賴于FFA的精確表現(xiàn)和臨床眼底的典型癥狀，對于活動性病變，臨床主張預(yù)防性治療。有研究表明，基因突變導(dǎo)致的無癥狀FEVR家庭成員中有58%具有一期和二期FEVR的臨床特征和血管造影證據(jù)［16］。本研究認(rèn)為，對于未表現(xiàn)出臨床癥狀的FEVR基因突變家系成員，熒光素眼底血管造影聯(lián)合基因測序技術(shù)與單純通過FFA和眼底表現(xiàn)做出的診斷相比，可以顯著提高FEVR的早期診斷率，進(jìn)而及時干預(yù)病程進(jìn)展，獲得更佳視力。

Robitaille等［24］發(fā)現(xiàn)FZD4基因突變可能會導(dǎo)致與PHPV相似的臨床表現(xiàn)，Tang等［25］也發(fā)現(xiàn)在FEVR病例家系中存在PHPV患者病例，說明PHPV和FEVR的臨床表型可能有重疊。本研究中的家系成員臨床表現(xiàn)與之前的報道相似。先證者表現(xiàn)為典型的雙眼周邊視網(wǎng)膜血管分支增多，分布密集，呈現(xiàn)典型的 “柳枝”樣形態(tài)，伴顳側(cè)牽引性視網(wǎng)膜脫離，和視網(wǎng)膜內(nèi)/下滲出，伴鐮狀視網(wǎng)膜固定褶皺。但是同樣基因突變致病的先證者姐姐卻發(fā)現(xiàn)左眼PHPV的特征表現(xiàn)，表現(xiàn)為后極部視網(wǎng)膜表面一灰白色條索樣增殖膜自視盤處向顳上方周邊視網(wǎng)膜延續(xù)，增殖膜下方視網(wǎng)膜表現(xiàn)出脫色素，伴視網(wǎng)膜色素上皮層萎縮及色素團(tuán)塊析出。上述結(jié)果表明，具有相同基因突變的多個個體可以表現(xiàn)出不同的臨床表型，反映出遺傳性FEVR的高度臨床異質(zhì)性，這對于進(jìn)一步了解基因型-表型非常重要。

綜上所述，本研究擴(kuò)大了FEVR的致病基因突變譜，并展示了FEVR基因型與臨床表型的復(fù)雜性。本研究表明FEVR具有高度的臨床異質(zhì)性，特別是對于沒有家族病史或非典型癥狀的患者，在臨床診斷和遺傳咨詢過程中不應(yīng)該基于基因型或表型單方面進(jìn)行分析，應(yīng)充分考慮基因型與表型之間的關(guān)聯(lián)，在為FEVR患者的家庭成員提供遺傳咨詢服務(wù)時，要進(jìn)行全面的眼底檢查。