癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜miR-205在鼻咽癌進(jìn)展中的作用

汪庚明， 郭術(shù)楠， 張雷， 周燕， 營(yíng)巧玲， 丁建明， 張亞軍， 江浩， 項(xiàng)平

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤胸外科；4.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心試驗(yàn)室）

鼻咽癌是一種源自于鼻咽部上部的鱗狀細(xì)胞癌，在東南亞及我國(guó)南方地區(qū)呈高發(fā)狀態(tài)。流行病學(xué)研究表明，近20年來(lái)，隨著人們生活方式改善，高危人群的篩查，影像學(xué)及治療技術(shù)的進(jìn)步，鼻咽癌發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但對(duì)高發(fā)地區(qū)來(lái)說(shuō)仍是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)［1-2］。目前研究認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素及EB病毒 （EBV）是鼻咽癌發(fā)生的主要原因，在幾乎所有低分化及未分化鼻咽癌中均檢測(cè)到EBV的表達(dá)［1-4］。外泌體是一種能被多種細(xì)胞分泌的小囊泡，直徑30～150 nm，剛開(kāi)始被認(rèn)為是一種細(xì)胞的廢棄物，后續(xù)研究逐漸發(fā)現(xiàn)并證實(shí)外泌體的作用。來(lái)源于EBV感染細(xì)胞的外泌體在EBV感染及致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而EBV在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，提示外泌體在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起著重要作用［5］。miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為23 nt的來(lái)自真核生物的小分子非編碼RNA，其作為致癌miRNAs或抑癌miRNAs，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［6］。研究顯示外泌體能夠攜帶功能性蛋白、mRNA和miRNAs到鄰近和遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的免疫功能，在血管生成、細(xì)胞增殖、腫瘤浸潤(rùn)和細(xì)胞間的信息交流中起著重要的作用［7-9］。進(jìn)一步提示外泌體在鼻咽癌中的作用可能是通過(guò)miRNAs實(shí)現(xiàn)的［10-11］。而其中 miR-205參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如乳腺癌、腎癌、胰腺癌［12-14］等，且miR-205是新發(fā)現(xiàn)的與鼻咽癌相關(guān)的miRNAs［15-16］。因此，本研究首先提取來(lái)自鼻咽癌細(xì)胞中的外泌體，并進(jìn)一步檢測(cè)miR-205在鼻咽癌細(xì)胞外泌體中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞系購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69購(gòu)于北納生物公司。

1.2 主要試劑和儀器 培養(yǎng)細(xì)胞外泌體提取試劑盒 （E1310）購(gòu)自于北京唯輝生物技術(shù)有限公司；Trizon Reagent、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒，HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒，BCA試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；兔抗CD63及Flotillin多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab59479、ab41927；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG （H＋L）均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為T(mén)A-08、 ZB-2301、 ZB-2305。

MF53倒置顯微鏡購(gòu)于廣州市明美光電有限公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀購(gòu)于Rayto公司；UV-1600PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于上海美譜達(dá)儀器有限公司；CFX ConnectTM實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)于伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品 （上海）有限公司。

1.3 外泌體的提取 收集細(xì)胞培養(yǎng)基，2 000 g，4℃，離心10 min去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片；轉(zhuǎn)移2 ml清澈的上清液 （無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基）到新的玻璃管1并放于冰上；在玻璃管2中，按照下列順序依次加入外泌體提取試劑盒內(nèi)溶液；渦旋混勻玻璃管2溶液5～10 s；將玻璃管2中的混合液添加到玻璃管1中；緊緊蓋住玻璃管1，劇烈渦旋混勻30 s，在4℃靜置20 min；混合液分層，用移液器小心移除丟棄培養(yǎng)基層，留下外泌體層；將管中的外泌體層轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中，然后5 000 g離心3 min，立刻移出并丟棄上層培養(yǎng)基顏色層，同時(shí)插入吸頭直到管的底部將 “底層無(wú)色液體”完全吸出，管中只保留外泌體；重復(fù)5 000 g離心3 min，然后重復(fù)上一步驟。在室溫下將管蓋打開(kāi)5～10 min晾干；加入約外泌體層4倍體積的1×PBS到管中。用移液器上下劇烈吹打40次使外泌體層重懸。在水平搖床上高速搖動(dòng)管子10 min。在這中間，重復(fù)用移液器上下吹打幾次；將管子5 000 g離心5 min，將上清液小心地轉(zhuǎn)移到過(guò)濾柱中，不要碰到沉淀；將柱子1 000 g離心5 min，收集所有流出的液體；流出的是分離后的純外泌體。

1.4 電子顯微鏡檢測(cè)外泌體 將分離純化得到的外泌體等體積加入PBS稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮耐饷隗w滴加于2 nm的銅網(wǎng)上，靜置10 min，用濾紙輕輕吸干多余液體，后轉(zhuǎn)移到4%的醋酸雙氧鈾溶液中10 min；取出銅網(wǎng)用濾紙吸干后，轉(zhuǎn)移到1%甲基纖維素液滴上5 min，PBS洗滌后，室溫晾干30 min，后于80 kV的透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外泌體中miR-205的表達(dá) 收集細(xì)胞，根據(jù)Trizon Reagent提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及純度（OD260/OD280說(shuō)明RNA純度良好），將RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，70℃ 10 min，再迅速冰浴2 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，操作體系：RNase Free dH2O29.5 μl，模板1 μl， 上游引物 1 μl， 下游引物 1 μl， 2×ULtraSYBR Mixture 12.5 μl；反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃，10 min，變性95℃，10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30次循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果利用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析， △△Ct＝ △Ct試驗(yàn)-△Ct對(duì)照， △Ct試驗(yàn)＝ Ct目的-Ct內(nèi)參， △Ct對(duì)照＝Ct目的-Ct內(nèi)參。 內(nèi)參上游引物： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物： 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′， 產(chǎn)物長(zhǎng)度89 bp；miR-205上游引物：5′-TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG-3′，下游引物：北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司提供通用引物。

1.6 Western blot法檢測(cè)CD63及Flotillin蛋白的表達(dá) 將適量的RIPA裂解液加入細(xì)胞中，裂解，離心收集上清液，獲得總蛋白。BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，進(jìn)行凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)PVDF膜。一抗溶液 （兔抗CD63及Flotillin多克隆抗體、小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度1∶100）孵育，4℃過(guò)夜；二抗溶液 （羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，稀釋度1∶1 000）中室溫孵育1～2 h。滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài) 從SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞系中分離出橢圓狀、或圓形的泡狀物。其中SUNE-1-5-8F細(xì)胞來(lái)源泡狀物大小不均，直徑40～130 nm，有完整的包膜；SUNE-1-6-10B細(xì)胞來(lái)源泡狀物大小較為均一，直徑約80 nm，有完整的包膜，且泡狀物內(nèi)電子致密物多；SUNE-1細(xì)胞來(lái)源泡狀物大小均一，直徑約100 nm，有完整的雙層包膜，包膜光滑清晰，且泡狀物內(nèi)電子致密物較多；NP69細(xì)胞來(lái)源泡狀物直徑約為30～150 nm的膜性囊泡，有典型的“杯盤(pán)”形態(tài)。見(jiàn)圖1。

2.2 外泌體特異性分子標(biāo)志物的表達(dá) 來(lái)源于SUNE-1-5-8F、 SUNE-1-6-10B、 SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞外泌體中的CD63及Flotillin蛋白表達(dá)量均顯著高于來(lái)源于正常鼻咽上皮細(xì)胞 NP69（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)此泡狀物為外泌體。見(jiàn)圖2。

圖1 電鏡下觀察鼻咽癌細(xì)胞及正常鼻咽上皮細(xì)胞中外泌體的形態(tài) （×100）

2.3 來(lái)源于鼻咽癌外泌體中miR-205的表達(dá) 來(lái)源于SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞外泌體中的miR-205表達(dá)量顯著高于來(lái)源于正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69（P＜0.05）。 見(jiàn)圖 3。

3 討論

圖2 外泌體特異性分子標(biāo)志物的表達(dá)

圖3 來(lái)源于鼻咽癌外泌體中miR-205的表達(dá)

外泌體是一種起源于細(xì)胞內(nèi)涵體的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，直徑約30～150 nm，在電鏡下呈橢圓形或球形。肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞均能夠分泌外泌體，外泌體能夠穩(wěn)定地表達(dá)CD63、CD8、TSG101等蛋白參與抗原的呈遞，能夠廣泛存在于血液、唾液、精液等多種體液中。1993年發(fā)現(xiàn)外泌體時(shí)，僅僅認(rèn)為外泌體是細(xì)胞代謝物的垃圾，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)外泌體含有獨(dú)特的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，具有獨(dú)特的生理功能［7-9］。外泌體能夠通過(guò)攜帶功能性蛋白、mRNA及miRNAs到靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞的增殖、血管生成、細(xì)胞間的信息交流起著調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而作為新型的分子標(biāo)志物參與腫瘤、心血管、肝、腎、脾等多種臟器相關(guān)疾病的診斷及預(yù)后［17-19］。最近研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體所攜的miRNAs參與鼻咽癌、乳腺癌等腫瘤組織中的發(fā)生、血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程［10-11］。譬如，研究發(fā)現(xiàn)miR-483-5p、miR-29c-3p等miRNAs在鼻咽癌外泌體中高表達(dá)，miR-29b-3p、let-7d-5p、miR-100-5p及 let-7g-5p在鼻咽癌外泌體中低表達(dá)［11］。攜帶miR-21的外泌體進(jìn)入受體細(xì)胞后能激活 STAT3，進(jìn)而上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及血管生成，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤的治療提供新的思路［20］。另外研究也發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞外泌體中miR-10b高表達(dá)，當(dāng)此外泌體被非轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞HMLE攝取后，能夠通過(guò)下調(diào)HOXD10及KLF4蛋白表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)HMLE細(xì)胞的侵襲性［21］。miR-23a在鼻咽癌組織中高度被富集，其表達(dá)水平與微血管密度呈正相關(guān)，另外過(guò)表達(dá)的miR-23a促進(jìn)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移與血管生成，同時(shí)還促進(jìn)了斑馬魚(yú)模型血管的生成；同時(shí)CNE2鼻咽癌細(xì)胞外泌體過(guò)表達(dá)miR-23a，并通過(guò)靶向調(diào)控TSGA10表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)血管生成，促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移［22］。在T細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，外泌體miR-214-24-3p增加了p-ERK、p-STAT1和p-STAT3的表達(dá)，同時(shí)降低了p-STAT5的表達(dá)。此外，通過(guò)體內(nèi)和體外研究證實(shí)FGF11是miR-214-24-3p的直接靶點(diǎn)，外泌體miR-214-24-3p阻礙了腺病毒FGF11轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞的增殖、Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞分化，但誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞分化，最終導(dǎo)致腫瘤的免疫抑制，影響鼻咽癌的疾病進(jìn)程［23］。

miR-205最初是通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件在紅鰭東方鲀和鼠的同源序列中被預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的，后在人和斑馬魚(yú)中被證實(shí)。人體 miR-205定位于染色體lq32.2的LOC642587基因中，具有顯著的組織特異性，能夠特異性地表達(dá)于人的胸腺、乳腺、前列腺等組織中，能夠通過(guò)調(diào)控多種靶基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、血管生成、耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程。而且miR-205在不同的腫瘤組織中表達(dá)具有差異性，在膀胱癌、卵巢癌、肺癌中高表達(dá)，而在乳腺癌、前列腺癌中低表達(dá)，在結(jié)腸癌組織中表達(dá)不具有差異性，說(shuō)明miR-205既可以作為致癌miRNAs促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，也可以作為抑癌miRNAs參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［24-25］。研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中外泌體miR-205高表達(dá)［26］。另外通過(guò)miRNAs序列分析發(fā)現(xiàn)3株膽管癌細(xì)胞及1株正常人膽管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)膽管癌細(xì)胞外泌體中有38個(gè)miRNAs表達(dá)明顯上調(diào)，460個(gè)miRNAs表達(dá)明顯下調(diào)。從而說(shuō)明外泌體miR-205參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用未知，因此本研究將對(duì)此展開(kāi)探討。

本研究首先采用試劑盒法提取了SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞系及正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69中的外泌體，并采用電鏡及Western blot法來(lái)證實(shí)外泌體的存在。電鏡結(jié)果表明鼻咽癌細(xì)胞中的泡狀物大小較為均一，直徑在30～150 nm，有完整包膜，同時(shí)囊泡內(nèi)含有電子致密物。另外Western blot結(jié)果表明SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞外泌體中的CD63及Flotillin蛋白表達(dá)量均顯著高于來(lái)源于正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69，進(jìn)一步證實(shí)此泡狀物為外泌體。緊接著本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)來(lái)源于鼻咽癌細(xì)胞及正常鼻咽上皮細(xì)胞外泌體中miR-205的表達(dá)，結(jié)果表明來(lái)源于SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞外泌體中miR-205表達(dá)量顯著高于來(lái)源于NP69正常鼻咽上皮細(xì)胞外泌體，此結(jié)果與miR-205在鼻咽癌組織中的表達(dá)［27］趨勢(shì)一致。

綜上所述，鼻咽癌細(xì)胞和正常鼻咽上皮細(xì)胞均提取出外泌體，來(lái)源于鼻咽癌細(xì)胞及正常鼻咽上皮細(xì)胞外泌體中均有miR-205的表達(dá)，但是來(lái)自于鼻咽癌細(xì)胞的外泌體中miR-205高表達(dá)，提示miR-205可能作為外泌體攜帶物參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。