HPLC法測定加味逍遙散復方中丹參酮ⅡA的含量

程金來 梁丹 冷靜

摘要：目的? 建立加味逍遙散復方中丹參酮ⅡA的測定方法。方法? 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（inertsil ODS-3柱 250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.1%磷酸，進行梯度洗脫;檢測波長：270 nm;流速：1.0 ml/min;柱溫：20℃。結果? 丹參酮ⅡA在0.0001～0.0005 μg范圍內呈現良好的線性關系[r=0.9991，平均回收率為97.36%（RSD=1.38%，n=6）]。結論? 本方法專屬性強，準確度高，重現性良好，可用于加味逍遙散的質量控制。

關鍵詞：加味逍遙散;含量測定;丹參酮ⅡA;HPLC

中圖分類號：R286.0? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.052

文章編號：1006-1959（2020）02-0165-03

Abstract：Objective? To establish a method for determination of Tanshinone ⅡA in Jiawei Xiaoyao San compound. Methods? An octadecylsilane bonded silica column （inertsil ODS-3 column 250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used; Mobile phase： acetonitrile-0.1% phosphoric acid， gradient elution; detection wavelength： 270 nm; flow rate： 1.0 ml/min; column temperature： 20℃. Results? Tanshinone IIA showed a good linear relationship in the range of 0.0001 to 0.0005 μg [r=0.9991， the average recovery was 97.36% （RSD=1.38%， n=6）]. Conclusion? This method has strong specificity， high accuracy and good reproducibility， and can be used for the quality control of Jiawei Xiaoyao San.

Key words：Jiawei Xiaoyao San;Content determination;Tanshinone IIA;HPLC

逍遙散原方出自《太平惠民合劑局方》，具有調和肝脾，疏肝解郁，養血健脾的功效。加味逍遙散在此基礎上加味而成，全方方藥組成為：柴胡10 g、當歸10 g、赤白芍15 g、黨參10 g、炒白術10 g、生甘草6 g、丹參20 g、炒二芽各10 g、延胡索15 g、丹皮10 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、梔子6 g、炒積實15 g、陳皮15 g。楊超[1]研究發現，加味逍遙散復方可以增強原發性肝癌患者實體瘤穩定率、調節其肝功能并降低腫瘤標志物的濃度。處方中丹參為主藥，丹參的主要成分為丹參酮ⅡA，現行質量標準測定不夠全面，為保證該處方的內在質量，研究采用高效液相色譜法（HPLC法）對該處方中丹參主要活性成分丹參酮ⅡA進行定量研究。

1儀器與試藥

1.1儀器? Agilnt1260型高效液相色譜儀;KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）;GX-20型搖擺式中藥粉碎機（上海榮舒工貿有限公司）;SHB-Ⅲ循水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）;HH-8 數顯恒溫水浴鍋（北京高信儀器設備有限公司）;調溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）;YP50001電子天平（上海越平科學儀器有限公司）;SQP 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）;RE52-99 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）;TF881 數顯鼓風干燥箱（吳江同豐烘箱電爐有限公司）;FYL-YS-50L恒溫箱（北京福意聯電器設備有限公司）。

1.2試藥? 丹參酮ⅡA對照品（批號：181120）購于上海融禾醫藥科技有限公司;乙腈為色譜純;甲醇和磷酸為分析純;水為自制重蒸水;其他試劑均為分析純;加味逍遙散所需中藥材購自廣西中醫藥大學第一附屬醫院，經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室廖月葵教授鑒定丹參本品為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）的干燥根及根莖。

2方法與結果

2.1色譜條件? 色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈為流動性A，0.1%磷酸為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫;流速：1.0 ml/min;柱溫：20 ℃;進樣量：10 μl;檢測波長：270 nm;理論板數按丹參酮ⅡA峰計算應不低于60000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備? 丹參酮ⅡA對照品溶液的制備：取丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定后，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含丹參酮ⅡA 20 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備? 按處方量精密稱取17味中藥材飲片，加入8倍量的85%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容備用，取濾液2 ml進行3000 r/min離心? ? ? ?10 min，過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液的制備? 按處方量精密稱取除丹參以外的16味中藥材飲片，加入8倍量的85%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容備用，取濾液2 ml進行? ? ? 3000 r/min離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3方法學考察

2.3.1陰性干擾試驗? 取“2.2”項下3種溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行分析測定，分別測定其峰面積。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜圖保留時間相同的位置上，有相應色譜峰，分離度均>1.5，并且陰性供試品無干擾峰出現，理論板數按丹參酮ⅡA峰計算不低于60000。表明陰性樣品中其他組分對丹參酮ⅡA的測定無干擾，見圖1。

2.3.2線性關系考察? 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μl進樣測定峰面積，按“2.1”項下色譜條件進行分析測定，分別測定峰面積。以對照品的進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得其回歸方程。結果：丹參酮ⅡA回歸方程Y=466.96X+48.848，相關系數r=0.9991。試驗結果表明，丹參酮ⅡA進樣量在4×10-3～2×10-2 μg，與峰面積呈現出良好的線性關系。

2.3.3精密度考察? 精密的吸取同一對照品溶液? ? 10 μl，按“2.1”項下色譜條件進行分析檢測，連續進樣6次，記錄其色譜峰的峰面積，計算。結果：丹參酮ⅡA RSD為2.74%，試驗結果顯示儀器精密度良好。

2.3.4重復性考察? 按“2.2.2”項下“供試品溶液的制備”方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下，精密吸取10 μl進樣分析，測定丹參酮ⅡA的含量，其RSD分別為0.19%，結果顯示該方法重復性良好。

2.3.5穩定性試驗? 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取10μl進樣分析，按“2.1”項下色譜條件，測定丹參酮ⅡA的峰面積，其RSD為0.10%。結果顯示該供試品具有穩定性良好。

2.3.6加樣回收試驗? 精密量取已知丹參酮ⅡA含量的供試品溶液，共6份，按“2.2.1”項對照品溶液制備方法制備濃度為0.2 mg/ml的丹參酮ⅡA對照品溶液，分別精密加入濃度為0.2 mg/ml的丹參酮ⅡA對照品儲備液4.0、8.0、12.0 ml，每個梯度平行兩份。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣的回收率，結果表明丹參酮ⅡA的平均回收率為97.36%，RSD%為1.38%（n=6）。

2.4樣品含量測定? 按處方量精密稱取3份上述17味藥材飲片，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析后，計算丹參酮ⅡA的含量76.93 μg/g（n=3）。

3討論

丹參酮ⅡA具有顯著擴張冠狀動脈、減慢心率、修復心肌、改善微循環及血液流變性、降低血脂、抗感染等作用[2]。丹參酮ⅡA是處方中主藥丹參的主要活性成分，其含量相對較高，現行質量標準測定不夠全面，通過實驗用HPLC法測定該方中丹參酮ⅡA的含量。參照2015年版《中國藥典》一部丹參含量測定項下的提取方法，方中藥物用8倍量的85%乙醇提取，提取丹參中丹參酮ⅡA較為完全。經試驗，流動相為乙腈-0.1%磷酸（75∶25，V/V）等度洗脫;流速：1.0 ml/min;柱溫：20℃;進樣量：10 μl;檢測波長：270 nm;測得結果比較理想，本法專屬性強，操作方便，準確度高，重現性良好，可以用于加味逍遙散的質量控制。

參考文獻：

[1]楊超.加味逍遙散聯合經皮射頻消融術治療21例原發性肝癌（肝郁脾虛型）的臨床療效觀察[D].湖北中醫藥大學，2012.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：105.

收稿日期：2019-10-12;修回日期：2019-11-02

編輯/肖婷婷