石淋通片中3個黃酮類成分含量測定

蔡安妮 何海霞 羅蘭

摘 ?????要：建立了石淋通片的質量控制方法。采用UV法測定石淋通片的總黃酮含量，HPLC法測定石淋通片中夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素的含量。色譜柱為Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），用甲醇-2.5 mmol/L醋酸銨溶液作為流動相，梯度洗脫，檢測波長為340 nm;流速為1 mL/min。經驗證，石淋通片的總黃酮含量在6.989～7.261 mg/g;夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素的線性關系良好，易于操作，儀器的精密度、樣品的穩定性和重現性良好，平均加樣回收率均在95%～105%之間。石淋通片中夏佛塔苷的最低含量為1.95 mg/g，異夏佛塔苷最低含量為0.80 mg/g，異牡荊素的最低含量為0.21 mg/g。該方法準確可靠，重復性好，可用于石淋通片的質量標準研究。

關 ?鍵 ?詞：石淋通片;總黃酮;夏佛塔苷;異夏佛塔苷;異牡荊素;含量測定

中圖分類號：R284.1???????文獻標識碼：R???????文章編號： 1671-0460（2020）03-0745-04

Content Determination of Three Flavonoids in Shilintong Tablets

CAI An-ni， HE Hai-xia， LUO Lan^*

（Xinhua College of Sun Yat-sen University， Guangdong Guangzhou 510520， China）

Abstract： The quality control method of Shilintong tablet was established. UV method was used to determine the total flavonoids content of Shilintong tablet. The contents of schaftoside， isophtalin and isovitexin in Shilintong tablet were ????????????????????simultaneously determined by HPLC with the Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5μm）using methanol-2.5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase at the rate of 1 mL/min under the detection wavelength of 340 nm. After methodological verification， the?total flavonoids content of Shilintong tablet was 25.78～26.56 mg/g，the calibration curves were linear for schaftoside， isophtalin and isovitexin.The precision of the instrument， the?stability and reproducibility of the sample were good. The?average recovery was 95%～105%.The minimum contents of schaftoside， isophtalin and isovitexin in Shilitong tablet were 1.95 mg/g， 0.80 mg/g and 0.21 mg/g，respectively. The method is accurate and has good repeatability. It can be used to research the quality standard of Shilintong tablet.

Key words： ?Shilintong tablet; ?total flavonoids;schaftoside; ?isophtalin;??isovitexin; ?content determination

石淋通片為廣金錢草提取物的單方制劑，具有清熱利尿、抗氧化、抗炎、堿化尿通淋排石之功效，常用于濕熱所致的熱淋、石淋，出現尿頻、尿痛、尿路結石、腎盂腎炎癥狀的患者^[1，2]。現代研究表明，廣金錢草中的主要活性成分是黃酮類化合物，其中含量較高并且具有明顯藥理作用的是夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素3種黃酮類成分^[3，4]。2015版中國藥典對廣金錢草中的夏佛塔苷成分做出了含量測定的規定，但卻未對石淋通片中的指標成分進行含量測定，而且這種單一的質量控制模式存在較大的缺陷。依據本研究的前期工作基礎，采用高效液相色譜方法研究建立了同時測定廣金錢草中3種黃酮類成分夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素的方法^[5-7]，可為石淋通片的質量控制提供一定實驗的依據。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1100 系列，美國安捷倫科技公司，含有四元梯度泵、二級管陣列檢測器、紫外檢測器、Chemstation 工作站），電子天平FA2004N（上海精密儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海福瑪實驗設備有限公司），UV-1102型紫外分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 ?試藥

蘆丁對照品（純度≥98%，酷爾生物，批號：B154199）、夏佛塔苷對照品（純度>98%，成都瑞芬恩生物科技有限公司）、異夏佛塔苷對照品（純度>98%，成都瑞芬恩生物科技有限公司）、異牡荊素對照品（純度>98%，上海融禾醫藥科技有限公司），石淋通片（廣東萬年青制藥有限公司）。甲醇為色譜純，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

2 ?實驗方法與結果

2.1 ?石淋通片總黃酮的含量測定

2.1.1 ?對照品溶液的制備

精密稱取在120 ℃下干燥至恒重的蘆丁標準品12 mg，置于50 mL量瓶中，加入60%乙醇適量，置水浴上微熱溶解，放冷，以60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 ?供試品溶液的制備

取本品10片（糖衣片為20片，除去包衣），研細，混勻，取供試品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇 25 mL，稱定重量，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，濾液蒸干，殘渣加50%甲醇適量使溶解，轉移至25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 ?測定波長的選擇

精密量取對照品溶液3 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，按紫外分光光度法進行掃描，顯示在511 nm處有最大吸收，確定檢測波長為511 nm。

2.1.4 ?標準曲線的繪制

精確量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分置于25 mL量瓶中，各加30%乙醇6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，在511 nm 波長處測定吸光度，以濃度（C）為縱坐標，吸光度（A）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：

A=15.841C-0.007 1，R²=0.999 9

2.1.5 ?精密度試驗

精密吸取對照品溶液3 mL，按2.1.4方法顯色，連續測定6次吸光度，計算 RSD為0.22%，結果表明儀器精密度良好。

2.1.6 ?穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（150931）3 mL，按2.1.4方法顯色，于室溫放置0、10、20、30、40 min測定吸光度，代入標準曲線并計算含量，其含量的RSD為1.74%，結果表明，供試品在40 min內測定穩定。

2.1.7 ?重復性試驗

取本品同一批樣品（150931）6份，按2.1.2方法平行制備供試品溶液，分別取3 mL，按2.4項下方法顯色， 測定吸光度，代入標準曲線并計算含量，其含量的RSD為1.35%。結果表明，此法重復性良好。

2.1.8 ?加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的石淋通片（S3）6份， 各2.0 g， 精密稱定。分別精密加入14.26 mg蘆丁對照品，加甲醇補足25 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，取3 mL，按2.4方法顯色測定，計算回收率為100.26%，RSD值為0.74%，見表1。

2.1.9 ?樣品含量測定

取3批廣金錢草樣品，按2.2項中所述的方法制備供試品溶液，精密吸取3 mL，按2.4方法顯色，測定吸光度，代入標準曲線并計算含量，測定結果見表2。

結果表明，3批石淋通片的總黃酮的含量在6.989～7.261 mg/g之間，RSD為1.91%

2.2 ?HPLC同時測定夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊素的含量

2.2.1 ?色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇-2.5 mmol/L醋酸銨溶液作為流動相，梯度洗脫：0～20 min，甲醇占比為30%→40%; 20～35?min，甲醇占比為40%→55%;35～45 min，甲醇占比為55%→70%;檢測波長為340 nm;流速為1 mL/min。

2.2.2 ?對照品溶液的制備

精密稱取對照品夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素適量，用甲醇分別溶解，均制成濃度為20 mg/mL的對照品溶液。分別精密量取各對照品溶液0.4、0.8、1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含0.8 mg/mL的夏佛塔苷，1.6 mg/mL的異夏佛塔苷，2 mg/mL異牡荊素的混合對照品溶液。

2.2.3 ?供試品溶液的制備

取本品10片（糖衣片為20片，除去包衣），研細，混勻，取供試品約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，取出，放冷，濾過，取續濾液，濾液再經微孔濾膜（0.45μm）濾過，即作為供試品溶液^[8]。

2.2.4 ?線性關系考察

精密量取按“2.2”方法配制的對照品貯備液0.05、0.1、0.5、1、1.5、2.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按2.1色譜條件分別進樣，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制圖標并計算回歸方程，結果見表3。

實驗結果表明：夏佛塔苷在0.10～4.00 μg（R²= 0.999 8 ）內線性關系良好，異夏佛塔苷在0.08～3.20?μg （R²=0.999 7 ）內線性關系良好，異牡荊素在0.04～1.60 μg （R²=0.999 9 ）內線性關系良好。

2.2.5??精密度試驗

精密吸取10 μL同一混合對照品溶液，平行進樣6次，按上述色譜條件進行檢測。可得結果，3種黃酮類成分夏佛塔苷的峰面積RSD值為0.27%、異夏佛塔苷的峰面積RSD值為0.29%和異牡荊素的峰面積RSD值為0.34%，故可得儀器精密度良好。

2.2.6 ?穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（150521）于0、2、4、8、12、16 h 連續進樣6次，每次進樣量為10 μL，按2.1項中的色譜條件進行檢測，記錄峰面積。結果得到3種黃酮類成分夏佛塔苷峰面積RSD值為1.39%、異夏佛塔苷峰面積RSD值為1.16%和異牡荊素的峰面積RSD值為2.72%，從以上結果可得樣品穩定性良好。

2.2.7 ?重復性試驗

取同一批石淋通片樣品（150521）6份，每份10片（糖衣片為20片，除去包衣），研細，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶，精密加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，取出，放冷，濾過，取續濾液，濾液再經微孔濾膜（0. 45μm）濾過，按此法平行制備供試品溶液6份，按2.1項中的色譜條件進行檢測，測定夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素成分的含量，可得RSD值分別為4.22%、4.09%和2.26%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 ?加樣回收率試驗

取6份，已知成分含有量的同一批石淋通片樣品（150521），精密稱定，每份0.25 g，并分別加入0.505 mg/mL的夏佛塔苷對照品溶液1 mL、0.202 mg/mL的異夏佛塔苷對照品溶液1 mL和0.052 mg/mL的異牡荊素對照品溶液1 mL，置25 mL量瓶用，甲醇稀釋至刻度，按2.3項中同樣的方法制備供試品溶液，按2.1項中的色譜條件進行檢測，計算平均回收率。見表4。

結果夏佛塔苷的平均回收率為100.43%，異夏佛塔苷的平均回收率為100.57%，異牡荊素的平均回收率為96.76%。

2.2.9 ?樣品含量測定

取3批石淋通片樣品（批號150931、150521、150312），每批3份，每份約0.5?g，按2.3項中相同方法制備供試品溶液，按上述相同色譜條件進行檢測，記錄本品中三個黃酮類成分（夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊素）的峰面積，按外標法計算，測定結果見表5。

由以上結果可知，夏佛塔苷的最低含量為1.95 mg/g，異夏佛塔苷最低含量為0.80 mg/g，異牡荊素的最低含量為0.21 mg/g。

3 ?討 論

3.1 ?對照品的選擇

據報道，廣金錢草含有的黃酮類成分很多（夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷等），不宜用其中一種成分的對照品直接進行總黃酮的含量測定。因蘆丁是比較常用的總黃酮類標樣，因此采用蘆丁對照品作為總黃酮的紫外分光光度法測定含量的標樣。

3.2 ?樣品的處理

本試驗參考有關資料[2，3]， 樣品用60%甲醇超聲提取， 并考察了超聲提取時間對樣品中夏佛塔苷提取的影響， 結果用60%甲醇超聲處理20、30 、45 min 測定結果相近。為確保提取完全， 故選擇超聲處理30 min。在蘆丁對照品和石淋通片的紫外檢測波長掃描中。在390 nm處有一較大的吸收峰，對390 nm吸收峰的機理仍不明確，需進一步研究。

3.3 ?實驗結果分析

在《中國藥典》2015年版一部中，石淋通片無含量測定項目。本文在廣金錢草3種成分含量測定的基礎上，對石淋通片的夏佛塔苷、異夏佛塔苷和異牡荊素3種黃酮類成分也作了檢測，發現同一藥廠生產的不同批次的樣品，夏佛塔苷的最低含量為1.95 mg/g，異夏佛塔苷最低含量為0.80 mg/g，異牡荊素的最低含量為0.21 mg/g，各指標成分的含量差別不大，質量相對穩定。

本試驗建立的采用UV測定石淋通片總黃酮的含量及HPLC同時測定石淋通片中3種黃酮類成分含量的方法，方法準確可靠，精密度良好。此方法能夠快速地檢測石淋通片中3種黃酮類成分含量，可為石淋通片的質量控制提供一定的實驗依據。

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