蟲草素的N-丙烯酰化的修飾

金英今，張敬東，王思宏，*，李東浩

（1.延邊大學分析測試中心，吉林延吉133002；2.延邊大學理學院，吉林延吉133002）

冬蟲夏草和蛹蟲草，是我國特有的傳統名貴中藥材，具有重要的食用與藥用價值。冬蟲夏草和蛹蟲草具有增強機體免疫力、降血壓、抗氧化、抗疲勞等多種活性功能，有極高的藥用價值，可作為藥材與其它中藥配伍，從而起到治療疾病的效果[1-2]。蟲草素（cordy－cepin）[3-5]為冬蟲夏草和蛹蟲草的活性成分之一[6]。1997年被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于淋巴細胞白血病的臨床試驗[7]。1976年，Johns等發現蟲草素進入生物體內后容易被腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）分解，為降低分解程度，臨床上需與腺苷脫氨酶抑制劑配對使用，或者對它的化學結構進行修飾，化學結構修飾除了能夠降低蟲草素在生物體內的分解率，還可能賦予蟲草素新的生物功效，比如作為前藥而發揮作用，蟲草素在ADA作用下快速脫氨基對其單獨用于體內實驗帶來很大的局限性，也使其作為藥物進行研發造成了一定的困難。蟲草素進入動物體后，主要是分子結構中的伯氨基容易被快速氧化。因此，如果通過化學結構修飾的手段，將該伯氨基用酰胺鍵保護起來，就有可能阻止其快速氧化，從而起到減緩蟲草素在體內的代謝速度的作用。以蟲草素為先導化合物，對其化學結構修飾，設計并創造出新的衍生物，是蟲草素開發利用最好的途徑。所以未來蟲草素在生物體內作用效率的研究重點將放在它的化學結構修飾方面上[8-9]。

aza-Michael反應是氨基與烯烴的共軛加成，被認為是100%原子效率。反應條件溫和，收率較高。該反應被廣泛關注和應用于藥物和天然產物的制備中，aza-Michael反應是制備功能性烷氧基硅烷的有效途徑之一。功能化磁性材料由于具有超順磁性、良好的生物相容性和較高的結合能力，大規模的應用在生物醫學樣品制備中。

因此以蟲草素為原料，丙烯酰氯為酰化劑，通過酰化反應，合成N-丙烯酰蟲草素。并與含氨基物質發生aza-Michael反應見圖1。

圖1 N-丙烯酰蟲草素合成的反應路線及aza-Michael反應Fig.1 Reaction route and aza-Michael reaction of N-acrylamide cordycepin

擬進行修飾的蟲草素與磁性材料雜化[10]。本文的研究將促進蟲草素的進一步研究和開發，對其他天然藥物和功能材料的研究和開發具有方法學上的指導意義和借鑒作用。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

AV-300核磁共振儀、maXis高分辨飛行時間質譜儀：Bruker公司；MPMS-XL-7振動樣品磁強計：美國Quantum Design公司；KH-50高壓釜：上海裕英儀器有限公司；SZ-93自動雙重蒸餾水器：上海亞榮生化儀器廠；柱層析硅膠（300目～400目）、GF254型薄層層析硅膠：青島海洋化工有限公司。

釹鐵強磁鐵：寧波永磁磁性材料廠；蟲草素、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、二甲基亞砜-d6（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）、甲 醇 -d4（methanol-d4，CD3OD-d4）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、丙烯酰氯、茚三酮、三乙胺（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；四水合氯化亞鐵、濃氨水、二氯甲烷、氯仿、石油醚（40℃～60℃）、甲醇、乙醇、無水硫酸鎂（分析純）：上海滬試實驗室器材股份有限公司。

1.2 N-丙烯酰蟲草素的合成

參考文獻的方法進行丙烯酰化反應[11]。在磁攪拌和氮氣保護下，將丙烯酰氯（5 μL，0.02 mmol）用二氯甲烷（2 mL）溶解后，冰水浴下，滴入用二氯甲烷（2 mL）溶解的蟲草素（5 mg，0.02 mmol）和三乙胺（3 μL，0.02 mmol）中，攪拌 1 h 后，加入石油醚（2 mL），析出白色沉淀，過濾，濾液濃縮，加水，乙酸乙酯（2 mL）提取3次，合并，無水硫酸鎂干燥，然后用硅膠柱（300目～400目硅膠）純化，洗脫液為氯仿∶甲醇=20∶1（體積比），將所得洗脫液濃縮，得到白色薄片狀產物，收率為96%。采用b型管測定熔點，化合物的熔點測定值未進行校正。蟲草素熔點：229℃～230℃，N-丙烯酰蟲草素熔點：126℃～127℃。比移值（Rf）0.76（氯仿 ∶甲醇=9∶1，體積比）。

1.3 N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲草素的合成

利用N-丙烯酰蟲草素的aza-Michael反應進行合成。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（4.0 mg，0.02 mmol），N-丙烯酰蟲草素（6.0 mg，0.02 mmol），甲醇（7 mL），室溫22℃反應2 d，產品為無色油狀物（100%）。Rf 0.33，氯仿 ∶甲醇=9∶1（體積比）。

1.4 Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素的合成

Fe3O4-NH2的水熱法合成。將四水合氯化亞鐵（1.25 g）溶解于7.75 mL水中。在劇烈攪拌下，添加濃氨水（6.25 mL），將懸浮液在空氣中連續攪拌10 min，使Fe（II）氧化。然后，加入2.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，將反應混合物放在體積為50 mL、溫度為130℃的KH-50高壓釜密封壓力容器中，3 h，將反應混合物冷卻至室溫（22℃），Fe3O4-NH2反復用5次蒸餾水洗滌，除去水溶性雜質[12]。

利用aza-Michael反應的Fe3O4-NH2的表面修飾。取干燥的兩頸瓶，加入DMF，稱取干燥的Fe3O4-NH2粉末，得到Fe3O4-NH2的分散液，在分散液中加入N-丙烯酰蟲草素，機械攪拌3 d，在釹鐵強磁鐵輔助下，用甲醇和水反復洗滌5次[10]。

1.5 抗菌活性測試

參照本課題組發表文獻進行，采用屎腸球菌Enterococcus faecalis 3511測試抗菌活性[13]。

2 結果與討論

蟲草素分子結構中，芳伯氨基和糖分子上的羥基均可能和烷酰氯發生酚化反應。但顯然芳伯胺基的氫比羥基氫活潑得多，當蟲草素分子和烷酰氯發生酰化反應的時候，是芳伯胺基首先和烷酰氯發生反應生成目標產物。反應過程中必須嚴格控制反應物的量、試劑滴加的速度和反應溫度，以防止副產物的大量產生。此外，應控制反應物中水分含量，以防止烷酰氯和反應體系中的水分反應生成大量的酸，否則會影響給反應物的純化。丙烯酰氯因分子結構中含碳碳不飽和雙鍵和氯原子基團，能發生多種類型的化學反應，進而衍生出較多種有機化合物[11]，故選擇其為酰化試劑。

DMSO-d6作為溶劑蟲草素的核磁共振氫譜數據，δ：8.33（1H，s，2-H），8.11（1H，s，8-H），7.25（2H，s，-NH2），5.835（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.625（1H，d，J=3.0 Hz，2`-H），5.13 （1H，m，4`-H），4.56 （1H，m，2`-OH），4.33（1H，m，5`-OH），3.65-3.95（1H，m，5`-Ha），3.51 （1H，m，5`-Hb），2.25-2.18 （1H，m，3`-Ha），1.92（1H，m，3`-Hb）。CD3OD-d4作為溶劑蟲草素的核磁共振氫譜數據。CD3OD-d4作為溶劑蟲草素的核磁共振氫譜數據，δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.70 （1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675 （1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），見圖 2。

因為溶劑效應，蟲草素的CD3OD-d4和DMSO-d6核磁共振譜圖表現出差異。DMSO-d6作為溶劑蟲草素展現了所有的氫的核磁共振吸收峰，而CD3OD-d4作為溶劑的蟲草素中的氨基和羥基因為與氘代試劑中活潑氫都未出現核磁共振吸收峰，而譜圖裂分精細，CD3OD-d4作為溶劑譜圖的峰盡管失去活潑氫的信息，但是有良好的分辨度，因而N-丙烯酰蟲草素選用CD3OD-d4作為溶劑測試核磁共振氫譜。

CD3OD-d4作為溶劑N-丙烯酰蟲草素核磁共振氫譜數據，見圖 2。核磁共振氫譜（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.42（1H，s，2-H），8.20（1H，s，8-H），6.15（1H，dd，J=3.0，6.0 Hz，3``-H），5.955（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），5.645（2H，dd，J=3.0，6.0 Hz，4``-H），4.70（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.54（1H，m，4`-H），3.925（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.675（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），2.38（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.06（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb）。核磁共振碳譜（CD3OD-d4，75 MHz），δ：177.4（C-2``），157.4（C-2），153.6（C-6），149.9（C-4），141.1（C-8），134.0（C-3``），127.7（C-4``），120.7（C-5），93.6（C-1`），82.6（C-4`），76.6（C-2`），64.2（C-5`），34.5（C-3`）。135度無畸變極化轉移技術圖譜（CD3OD，75 MHz），δ：153.61（CH，C-6），141.14（CH，C-8），134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），120.7（CH，C-5），93.6（CH，C-1`），82.6（CH，C-4`），76.6（CH，C-2`），64.2（CH2，C-5`），34.5（CH2，C-3`）。二維氫氫相關譜中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）；3.925（5`-Ha），3.675（5`-Hb）；2.38（3`-Ha），2.06（3`-Hb）是相關的。高分辨質譜，m/z：304.1122[M-H]-，計算值：305.112 4。

圖2 蟲草素和N-丙烯酰蟲草素核磁共振譜對比圖Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectra of cordycepin and N-acrylamide cordycepin

比較蟲草素和N-丙烯酰蟲草素的核磁共振氫譜圖，觀察新增或減少的質子峰的種類和數量與目標化合物N-丙烯酰蟲草素的吻合程度。N-丙烯酰蟲草素的核磁共振氫譜數據中新出現δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰，核磁共振碳譜中新出現177.4（C-2``），134.0（C-3``），127.7（C-4``）峰，135 度無畸變極化轉移技術圖譜中新出現 134.0（CH，C-3``），127.7（CH2，C-4``），二維氫氫相關譜中 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰具有相關性，異核多量子相關譜圖（HMQC）中δ：6.15（3``-H）對應 δ：134.0（C-3``），δ：5.645（4``-H）對應δ：127.7（C-4``），是丙烯酰中的烯鍵氫的相關性。因為氨基的親核性大于羥基，丙烯酰反應保留了蟲草素的糖原部分，丙烯酰反應選擇性發生在蟲草素中的氨基部分。綜上幾種核磁譜圖和高分辨質譜數據，結合生成產物的Rf值、熔點等理化參數，也進一步印證了蟲草素連接上丙烯酰鍵[6]。

3-氨基丙基三乙氧基硅烷與N-丙烯酰蟲草素中烯烴發生了aza-Michael反應，核磁共振氫譜中（CD3OD-d4，300 MHz），δ：8.41 （1H，s，2-H），8.19（1H，s，8-H），5.945（1H，d，J=3.0 Hz，1`-H），4.705（1H，quint，J=3.0 Hz，2`-H），4.53（1H，m，4`-H），3.92（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Ha），3.67（1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，5`-Hb），3.34 （m，2H，CH2），2.71（m，2H，CH2），2.64（m，2H，CH2），2.36（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Ha），2.065（1H，ddd，J=3.0，6.0，9.0 Hz，3`-Hb），1.63（m，8H，4×CH2），0.65（m，9H，3×CH3）。核磁共振碳譜（CD3OD-d4，75 MHz），δ：173.7（C-2``），152.4（C-2），151.8（C-6），149.8（C-4），140.3（C-8），123.5（C-5），99.3（C-1`），82.4（C-4`），74.8（C-2`），63.8（C-5`），58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），34.5（C-3`），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2）。高分辨質譜，m/z：527.256 9[M+H]+，計算值：526.257 1[14]。N-丙烯酰蟲草素的核磁共振氫譜 δ：6.15（3``-H），5.645（4``-H）峰消失，新增加了 δ：3.34（CH2），2.71（CH2），2.64（CH2），1.63（4×CH2），0.65（3×CH3）峰，以及核磁共振碳譜中134.0（C-3``），127.7（C-4``） 峰消失，新出現 δ：58.4（3×OCH2），52.4（-NHCH2），49.5（-NHCH2），35.2（CH2），25.8（CH2），18.4（3×CH3），14.1（CH2），N-丙烯酰蟲草素的核磁共振氫譜和核磁共振碳譜發生變化，對比N-丙烯酰蟲草素的核磁共振氫譜和核磁共振碳譜、高分辨質譜、Rf值，表明3-氨基丙基三乙氧基硅烷與N-丙烯酰蟲草素完成了反應，生成了N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲草素。借鑒這個模板反應，利用aza-Michael反應的優點，進行表面含有氨基的磁性材料的修飾，通過茚三酮比色法、x射線粉末衍射、磁滯回線對比追蹤了雜化反應進程。

按《中國藥典》方法配制茚三酮溶液（2 g茚三酮，溶于100 mL乙醇即得）[15]，Fe3O4-NH2中氨基的茚三酮反應中是紫色，發生了aza-Michael反應，反應完全后紫色消失。Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素x射線粉末衍射圖譜見圖3。

圖3 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素x射線粉末衍射圖譜Fig.3 X-ray powder diffraction patterns of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin

由圖3所示，N-丙烯酰蟲草素和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素衍射峰的變化。衍射峰的位置Theta 30°～60°有衍射峰，與磁鐵礦（Joint Committee on Powder Diffraction Standards，JCPDS 89-4319） 的位置是一致的，Theta 15°～30°寬峰表明了顆粒的雜化中的有機化合物的存在。

雜化前Fe3O4-NH2磁飽和率為80.0 emu/g，雜化后Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素變為50.0 emu/g，雜化前后磁飽和率的差異顯示蟲草素被修飾了，見圖4。

圖4 Fe3O4-NH2和Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素磁滯回線Fig.4 Magnetic moments of Fe3O4-NH2and Fe3O4-NH2@N-acrylamide cordycepin

蟲草素、N-丙烯酰蟲草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）分別為 16、1.6、3.2 μg/mL。蟲草素、N-丙烯酰蟲草素、Fe3O4-NH2@N-丙烯酰蟲草素抗菌生理活性的差異，意味著蟲草素修飾后氨基是穩定的[16]。

3 結論

用反應位點多的丙烯酰基對蟲草素中的氨基進行了N-丙烯酰基修飾，并結構確認，新合成出的N-丙烯酰蟲草素，能100%與3-氨基丙基三乙氧基硅烷發生aza-Michael反應，生成N-[1-氧代丙烷-3-（3-（三乙氧基硅基）丙基）氨基]蟲草素。借鑒這個思路，用N-丙烯酰蟲草素進行了水熱法合成的Fe3O4-NH2的表面修飾。蟲草素經化學結構修飾后，可以達到延緩蟲草素體內代謝速度的目的。蟲草素改變成丙烯酰后，其抗菌活性和蟲草素相比，其對枯草桿菌的MIC降低了近10倍，是一個值得進一步深入研究和有潛在開發利用價值的新化合物，藥物作用機制等問題還有待進一步實驗的研究和確證。

本文將生物、有機合成、有機無機雜化以及藥物化學理論應用于天然藥物活性成分的研究開發中，全面提升天然藥物活性成分的生產水平，大力降低其生產成本，并以天然活性成分為先導化合物、通過化學結構修飾的手段研究開發具有更高藥理活性的新型藥物，對其它天然藥物的研究和開發具有方法學上的指導意義和借鑒作用。