5種豆類中總多酚、總黃酮含量及抗氧化活性比較研究

劉仙俊，張慧珍，王瀟瀟，李合，李波

（太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原030021）

豆類中含有豐富的多酚類、黃酮類等生物活性物質，這些生物活性物質被稱為天然抗氧化劑，具有清除人體內多余的自由基，保護機體免受活性氧自由基攻擊而導致的人體內脂質過氧化、酶失活、核酸和蛋白質損傷等，能夠減緩衰老、增強人體免疫力，并防止人體內發炎、癌變、動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病的產生[1-13]。

國內外對豆類生物活性物質的研究有很多報道，Singh等研究表明綠豆總多酚的總抗氧化活性、鐵還原力和DPPH自由基清除活性都比較好[14]。Zhou等研究發現紅刀豆種皮中含有豐富的多酚類物質[15]。Herrera-Hernández研究了墨西哥薩卡特卡斯半干旱條件下生長的大豆，發現其具有豐富的生物活性物質和較強抗氧化能力[16]。曹柏營等研究發現黑豆花青素對鐵離子螯合劑和羥基自由基有較高的清除力[17]。鞏藹等研究了云南8種特色豆，表明其具有較高的總多酚含量和較強的抗氧化性能[18]。程安瑋等研究表明蠶豆等4種豆類中的結合態多酚具有較高的抗氧化性[19]。王德萍等研究發現鷹嘴豆乙醇提取物具有一定的降血糖作用[20]。任嬌艷等研究表明白扁豆水提物對幽門螺桿菌損傷人胃黏膜上皮細胞具有一定的修復作用[21]。

本研究以黑豆、綠豆、紅小豆、大豆和豇豆5種豆類為研究材料，比較其乙醇提取物總多酚和總黃酮含量及4種體外抗氧化活性，進行相關性分析，為我國豆類資源的開發利用和豆類保健品的研制提供理論科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆、綠豆、紅小豆、大豆、豇豆：市售，優質且含水量＜5%。

沒食子酸標準品、蘆丁標準品：美國Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚：上海源葉生物科技有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海生工生物工程股份有限公司；硫酸亞鐵七水合物：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、水楊酸、抗壞血酸、過氧化氫、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5200型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；D-37520型臺式離心機：德國賽默飛世爾科技公司；FA1004電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-2A型電熱恒溫水浴鍋、FW-200型高速萬能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C型酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DZC-403型真空干燥箱：天津天宇機電儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品溶液的制備

豆類樣品于60℃烘干10 h，粉碎成末后過60目篩，準確稱取2 g樣品粉末，按1∶10（g/mL）的料液比加入體積分數為70%的乙醇溶液，以250 r/min的轉速60℃下恒溫振蕩提取2 h，7 000 r/min離心8 min，取上清液，殘渣在相同條件下重復提取1次，合并兩次上清液并定容備用，每個樣品設3個重復。

1.3.2 豆類中總多酚含量的測定

1.3.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

參照文獻[22]繪制沒食子酸標準曲線，所得線性回歸方程：Y=139.39X+0.026，回歸系數R2=0.995 3。

式中：Y為吸光度；X為沒食子酸標準液濃度，mg/mL。

1.3.2.2 總多酚含量測定

準確吸取1 mL樣品溶液于25 mL的具塞試管中；分別加入福林酚試劑1 mL及質量分數為12%的碳酸鈉溶液2 mL并定容至刻度線，室溫25℃下避光反應2 h；在765 nm波長處測定樣品的吸光度，并根據標準曲線和計算公式得出豆類總多酚的含量。總多酚含量的計算公式如下。

式中：P為豆類總多酚含量（以沒食子酸計），mg/g；C為根據標準曲線所算得反應液總多酚濃度，mg/mL；V為反應液體積，mL；N為稀釋倍數；M為所稱取的豆粉質量，g。

1.3.3 豆類中總黃酮含量的測定

1.3.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

參照文獻[23]繪制蘆丁標準曲線，所得線性回歸方程：Y=10.736X+0.007 1，回歸系數R2=0.998 7。

式中：Y為吸光度；X為蘆丁標準液濃度，mg/mL。

1.3.3.2 總黃酮含量的測定

準確吸取樣品溶液2.0 mL放置于10 mL的容量瓶中；加3 mL體積分數為70%的乙醇溶液，再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL，再用70%的乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min；在510 nm下測定吸光度，并根據標準曲線和計算公式得出豆類總黃酮的含量。總黃酮含量的計算公式如下。

式中：P為豆類總黃酮含量（以蘆丁計），mg/g；C為根據標準曲線所算得反應液總黃酮濃度，mg/mL；V為反應液體積，mL；N為稀釋倍數；M為所稱取的豆粉質量，g。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

準確移取0.5 mL樣品溶液于試管內，再取兩支空試管，向其中分別加入0.5 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和0.5 mL蒸餾水（空白），然后向各試管分別加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL，混合均勻后于37℃恒溫避光水浴30 min，冷卻至室溫25℃，測定波長515 nm處的OD值。

DPPH·清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.3.5 羥基自由基（·OH）清除能力的測定

取樣品溶液0.5 mL置于試管內，再取兩支空試管，向其中分別加入0.5 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和0.5 mL蒸餾水（空白），各試管再分別加入0.15 mmol/L FeSO4溶液 1 mL、2 mmol/L 水楊酸 0.4 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL及蒸餾水0.4 mL，振蕩搖勻，37℃下恒溫水浴1 h，冷卻至室溫25℃，測定波長510 nm處的OD值。

·OH 清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.3.6 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

取3支干燥潔凈的試管分別加入0.2 mol/L的Tis-HCL緩沖液（pH 8.2）4.0 mL，再各加入 0.5 mL樣品液、0.5 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和0.5 mL蒸餾水（空白），混勻后，置于25℃恒溫水浴，反應4 min后立即加2滴8 mol/L的HCL終止反應，并測定波長為420 nm處的OD值。

O2-·清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.3.7 過氧化氫（H2O2）清除能力測定

用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）將H2O2配置成40 mmol/L的H2O2溶液，取3支試管分別加入0.6 mL配置好的H2O2溶液，再向其中各加入3.4 mL樣品溶液、3.4 mL抗壞血酸溶液（陽性對照）和3.4 mL蒸餾水（空白），混勻，230 nm處測定其OD值。

H2O2清除率/%=[1-（OD樣品-OD對照）/OD空白]×100

1.4 數據統計分析

所有處理均重復3次，數值表示為平均值±標準差（SD），采用SPSS 17.0統計軟件進行相關性及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 豆類中總多酚和總黃酮含量比較

5種豆類的總多酚和總黃酮含量見表1。

表1 5種豆類中總多酚和總黃酮含量Table 1 The contents of total polyphenols and total flavonoids in five samples

由表1可知，5種不同豆類的總多酚含量存在一定差異，其中黑豆總多酚含量最高，其含量高達6.33mg/g，這可能與黑豆皮中含有比較多的花青素有關，其次是紅小豆，總多酚含量為3.73 mg/g，綠豆、大豆和豇豆的總多酚含量較低，在2.05 mg/g～2.18 mg/g范圍內，且3者之間的總多酚含量差異不顯著（P＞0.05）。

從表1可以看出，5種不同豆類的總黃酮含量也存在一定差異，其中黑豆總黃酮含量最高，為4.09 mg/g，其次為紅小豆和豇豆（分別為2.61 mg/g和2.08 mg/g），綠豆和大豆的總黃酮含量較低，且二者之間不存在顯著差異（P＞0.05），分別為 1.51 mg/g和 1.50 mg/g。由表1可知，5種豆類的總黃酮含量都低于其總多酚含量，這是可能由于大多數的黃酮類化合物都屬于多酚類物質。

2.2 5種豆類的抗氧化活性比較

各種抗氧化成分的抗氧化機理不同[24]，由于不同豆類的抗氧化活性成分及含量有一定差異，所以要研究其抗氧化活性需要綜合不同的檢測方法，本研究通過對 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2的清除能力來分析5 種豆類的抗氧化活性，具體結果見表2。

表2 5種不同豆類的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of five different samples

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH·是一種非常穩定的自由基，被廣泛用于天然成分的體外抗氧化活性研究，在自由基清除劑（如多酚類、黃酮類物質）存在下，其溶液會由深紫色逐漸變為淺黃色或無色，通過觀察515 nm處吸光度值的變化就可以計算某物質的DPPH·清除率[25]。

5種不同豆類對DPPH·的清除率見圖1。

圖1 5種不同豆類對DPPH·的清除率Fig.1 DPPH·clearance rates of five different samples

從表2和圖1可以看出不同豆類DPPH·清除率有明顯差異，其中清除率最高的是黑豆，高達80.92%，這可能與黑豆中含有較高的總多酚和總黃酮有關，其次是紅小豆和綠豆，清除率也比較高，分別為72.21%和72.02%，且二者不存在顯著差異（P＞0.05），豇豆和大豆的清除率略低，分別為59.41%和54.54%，且二者差異顯著（P＜0.05）。

2.2.2 羥基自由基清除能力

·OH是一種非常重要的活性氧，具有極強氧化性即得電子能力，所以對生物體毒害作用非常強，可以導致細胞損傷和各種疾病[24]。

5種不同豆類對·OH的清除率見圖2。

圖2 5種不同豆類對·OH的清除率Fig.2·OH clearance rates of five different samples

如表2和圖2顯示，5種不同豆類·OH清除率具有顯著差異（P＜0.05），其中大豆的清除率最高，為87.11%，其次是黑豆、紅小豆和綠豆，分別為77.42%、73.25%和69.02%，豇豆的·OH清除率最低，為52.13%。

2.2.3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力

O2-·是一種活性氧自由基，可以導致人體內脂質過氧化，加快衰老，并誘發各種皮膚病、癌癥和心血管疾病等，嚴重損害人體健康，O2-·在人體內可以被超氧化物歧化酶和攝入的一些抗氧化劑清除[26]。

5種不同豆類對O2-·的清除率見圖3。

圖3 5種不同豆類對O2-·的清除率Fig.3 O2-·clearance rates of five different samples

由表2和圖3可以看出，5種不同豆類O2-·清除率也存在顯著差異（P＜0.05），其中黑豆的清除率最高，高達81.62%，其次是紅小豆、豇豆和大豆，分別為75.60%、68.95%和56.98%，綠豆的O2-·清除率最低，為54.57%。

2.2.4 過氧化氫（H2O2）清除能力

按結構劃分H2O2并不屬于自由基范疇，但其對人體的損傷作用與自由基相似，主要體現在對人體生命大分子的損害，是造成衰老和疾病的重要原因之一[24]。目前體外H2O2清除能力測定的方法主要是分光光度法[24]。

5種不同豆類對H2O2的清除率見圖4。

由表2和圖4可知，5種不同豆類的H2O2清除率相比前3種自由基的清除率來說都不高，清除率最大的是豇豆，為39.58%，其次為紅小豆，清除率38.06%，大豆和黑豆的H2O2清除率差異不顯著（P＞0.05），分別為36.79%和36.73%，清除率最低的是綠豆，為35.45%。

2.3 豆類中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性

利用SPSS 17.0統計軟件對5種不同豆類總多酚、總黃酮含量及其 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2清除能力之間進行雙變量相關性分析，所得Pearson相關系數及雙側顯著性檢驗結果見表3。

圖4 5種不同豆類對H2O2的清除率Fig.4 H2O2clearance rates of five different samples

表3 豆類總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性Table 3 The coefficients among the contents of total polyphenols，total flavonoids and the antioxidant activity of five samples

由表3可以看出，5種不同豆類的總多酚含量和總黃酮含量呈現極顯著正相關（P＜0.01），這可能是由于大多數黃酮類化合物都屬于多酚類物質；豆類總多酚含量與DPPH·、·OH和O2-·清除率之間都呈正相關，其中與DPPH·和O2-·清除率之間的相關性比較高；豆類總黃酮含量和四種抗氧化活性之間都呈正相關，其中與 O2-·清除率之間呈顯著正相關（P＜0.05），與DPPH·清除率的相關性也比較高。

3 結論

對黑豆、綠豆、紅小豆、大豆和豇豆5種豆類的總多酚、總黃酮含量進行分析。結果表明，5種不同豆類的總多酚含量在2.05 mg/g～6.33 mg/g的范圍內，總黃酮含量在1.50 mg/g～4.09 mg/g的范圍內，其含量在不同豆類間存在明顯差異，其中黑豆的總多酚和總黃酮含量都最高，分別為6.33 mg/g和4.09 mg/g。

采用4個指標對4種豆類進行分析，結果發現不同豆類對 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2的清除能力存在明顯差異，這可能是由于不同豆類所含的抗氧化成分不同，以致其抗氧化機理也不盡相同。5種豆類對DPPH·、·OH和O2-·的清除率都比較高，其中黑豆的清除力最強，對3種自由基的清除能力分別為80.92%、77.42%和81.62%。

相關性分析表明5種豆類的總多酚和總黃酮含量之間呈極顯著正相關（P＜0.01），這可能是由于大多數黃酮類化合物都屬于多酚類物質。這兩種活性成分含量與DPPH·、·OH和O2-·清除能力之間都呈正相關，其中總黃酮含量和O2-·清除能力之間呈顯著正相關（P＜0.05）。

綜上，5種豆類含有豐富的多酚類和黃酮類物質，并具有較強的抗氧化性能，這將為豆類保健品的研制和天然抗氧化劑的開發利用提供參考。