山楂不同溶劑提取物的抗氧化活性及對DNA和蛋白質氧化損傷的保護作用

張亮亮，張展諾，閆可婧，額日赫木，張麗芳，徐建國，*

（1.山西師范大學化學與材料科學學院，山西臨汾041004；2.山西師范大學食品科學學院，山西臨汾041004；3.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名紅果、山里紅等，屬薔薇科，是一種多年生木本植物，在我國北方廣泛種植。山楂是衛生部批準的藥食兩用水果，營養豐富，具有消食健胃、行氣散瘀的功效[1-2]。許多研究表明，山楂富含維生素C（890 mg/kg FW）、多糖（10.23%～14.25%）、多酚（61.84 mg RE/g）、黃酮（33.56 mg GAE/g）等功能性物質，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、降血糖、降血脂和神經保護等活性作用[1-6]。鐘麗霞等[6]優化了山楂多糖的提取條件，并表明山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂活性；何彩梅等[7]研究了山楂70%乙醇提取物的組成成分及抗氧化能力；張曉波等[8]研究了不同品種山楂80%丙酮提取物的抗氧化能力；努爾阿麗耶·阿卜力米提等[4]研究了新疆山楂水和乙醇提取物的清除自由基能力及抑菌作用。除此之外，研究表明山楂原花青素可通過影響抗氧化酶活力和細胞凋亡相關蛋白來抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖，促進細胞凋亡[5]。

但目前有關不同溶劑對山楂提取物的活性物質含量及其生物活性影響的研究還未見詳細報道。為有效開發山楂資源，本文對山楂不同溶劑提取物的抗氧化活性進行了初步研究。本研究以山楂為材料，采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等6種不同極性的溶劑分別提取山楂中的總黃酮、總多酚類物質，分析其主要的化學成分，研究不同溶劑提取物的抗氧化能力及其對DNA和蛋白質氧化損傷的保護作用，為山楂資源的開發利用及功能食品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大金星山楂：10月上旬采摘于本地果園，經去核、晾干后粉碎，密封低溫保存備用。兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、槲皮素、對苯二甲酸、金絲桃苷、異槲皮苷：上海源葉生物科技有限公司；1，1苯基-2-苦 肼 基 自 由 基 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯氮-3-乙苯-二噻唑-6 磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、Fe3+-三吡啶三吖嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：Sigma公司；pBR322質粒DNA：大連寶生物公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學有限公司。

RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；Centrifuge 5804R型冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取物制備

準確稱取干燥的山楂，粉碎過40目篩，按照1∶10（g/mL）的料液比，分別加入不同溶劑，25℃振蕩2 h，收集上清液，重復3次。將上清液混合后減壓濃縮，將得到的浸膏經真空冷凍干燥，分別得到甲醇提取物（methanol extract，ME）、乙醇提取物（ethanol extract，EE）、丙酮提取物（acetone extract，AE）、乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract，EAE）、氯仿提取物（trichloromethane extract，TE）和石油醚提取物（petroleum ether extract，PE）。

1.2.2 總黃酮含量測定

參照文獻[9]的試驗方法，稱取一定量的提取物，溶解，取0.1mL樣液，加入0.15mL5%NaNO2溶液，25℃放置6 min后加入0.15 mL濃度為10%的Al（NO3）3溶液，反應6 min，加入4%的NaOH溶液2 mL，并用蒸餾水定容到5 mL，反應3 min后，測定混合液在508 nm處的吸光度值。同時以蘆丁標品溶液做標準曲線，擬合的回歸方程y=2.403 5x+0.004 9（R2=0.999 2）。總黃酮含量測定結果以每克山楂中所含的蘆丁（rutin）的量表示（mg RE/g）。

1.2.3 總多酚含量測定

參照文獻[9]的試驗方法，準確移取0.1 mL樣液，向其中加入2.8 mL蒸餾水，0.1 mL 1 mol/L的Folin-酚試劑，混勻，25℃避光反應8 min，再加入2 mL 7.5%Na2CO3，避光2 h，測其在765 nm處的吸光度值。以沒食子酸標品溶液做標準曲線，擬合回歸方程為y=1.558 2x+0.008 2（R2=0.999 6）。總多酚含量的測定結果以每克山楂中所含的沒食子酸的量表示（mg GAE/g）。

1.2.4 組成成分分析

提取物的成分分析方法參照文獻[10]略作修改。選用 C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），采用三氟乙酸（1%）作為流動相 A，用乙腈/甲醇（80∶20，體積比）作為流動相B。進樣量為10 μL，柱溫保持在35℃，流動相下洗脫流速1 mL/min，洗脫過程為：0～5 min，3%B；5min～12min，3%～10%B；12min～25min，10%～18%B；25 min～35 min，18%～20%B；35 min～40 min，20%～80%B；40 min～45 min，80%～3%B；45 min～50 min，3%B。各組分在280 nm的吸光度值被檢測。標準品兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、槲皮素、對苯二甲酸、金絲桃苷、異槲皮苷在同樣的條件下進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，并以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。樣品成分根據對比標準品的保留時間定性，含量根據標準曲線計算。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定

參考文獻[11]的方法，量取500 μL不同濃度的山楂提取物于試管中，添加2.5 mL的DPPH溶液，避光反應30 min，測量其在517 nm波長處的吸光度值，計算DPPH自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率為50%時添加的提取物的濃度）表示。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測定

參考文獻[11]的方法，量取100 μL不同濃度的山楂提取物于試管中，添加3.8 mL的ABTS溶液，避光反應6 min，在734 nm處測定吸光度值，計算ABTS自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率為50%時添加的提取物的濃度）表示。

1.2.7 鐵還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定

參考文獻[11]的方法，量取100 μL山楂提取物于試管中，加TPTZ溶液1.8 mL，37℃反應30 min，立即記錄反應體系在593 nm處的吸光度值。同時以FeSO4·7H2O 做標準曲線（100 μmol/L～1 000 μmol/L），得回歸方程為 y=0.000 6x+0.003 5（R2=0.993 8），鐵還原能力結果以每克山楂相當于μmol Fe（II）表示（μmol Fe（II）/g）。

1.2.8 蛋白質氧化損傷的保護試驗

試驗方法參考文獻[12]，量取5 μL1 mg/mL的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，依次加入5 μL 山楂提取物、5 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 緩沖溶液、2.5 μL10 mmol/L 的硫酸銅溶液和 2.5 μL 雙氧水（50 mmol/L），搖勻，放入 37℃水浴1 h。空白組用PBS緩沖液替代山楂提取物。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白質，在凝膠成像記錄儀中拍照，并通過灰度值計算其相對保護率。

1.2.9 DNA氧化損傷的保護試驗

試驗方法參考文獻[11]，取1 μL的pBR322 DNA，加入 14 μL 的 PBS 緩沖溶液（pH 7.4），5 μL 山楂提取物，然后加入2.5 μL 1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2.5 μL 1 mmol/L雙氧水，混合均勻并置于37℃水浴中反應30 min，取出后立即進行瓊脂糖電泳檢測，在凝膠成像記錄儀中拍照，并通過灰度值計算其相對保護率。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次，數據結果表示為平均值±標準偏差。數據采用Excel 2013、SPSS 24.0軟件進行統計學分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同提取物中總黃酮、總多酚含量

山楂不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量測定結果見圖1。

圖1 不同溶劑提取物中總黃酮和總多酚含量Fig.1 Contents of total phenolics and flavonoids of different solvents extracts

由圖1得知，不同提取物中的總黃酮含量存在明顯差異，其中ME中總黃酮的含量最高（61.84mgRE/g），其次為 EE（44.42 mg RE/g）、AE（12.78 mg RE/g）、EAE（3.08 mg RE/g）、TE（2.59 mg RE/g），PE中總黃酮含量最低為0.59 mg RE/g。與總黃酮含量的變化相似，ME中總多酚含量最高為38.40 mg GAE/g，EE中多酚含量為37.99 mg GAE/g，但ME和EE二者之間總多酚含量無顯著差異；其余提取物中總多酚含量由高到低依次為 AE（33.56 mg GAE/g）、EAE（17.12 mg GAE/g），TE（4.48 mg GAE/g）和 PE（2.66 mg GAE/g）。試驗結果表明，隨著提取溶劑極性的不斷增加，山楂中總黃酮和總酚類物質的溶解程度也隨之增加，這與一些以前的研究報道相一致[9，13]，符合酚類物質主要為溶解在中等和高極性溶劑中的特征。然而提取劑極性與酚類物質含量并非一一對應，如田強等[14]報道厚樸葉的乙醇提取物中的總酚含量遠遠高于其甲醇提取物；陸健等[15]報道大麥的丙酮提取物中多酚的含量大于甲醇提取物。這些差異可能與原料種類、產地、提取方法及其酚類物質的組成成分有關。

2.2 不同提取物的成分組成

不同提取物成分含量見表1。

表1 不同提取物成分含量Table 1 Chemical components in extracts of different solvents mg/100 g DW

由表1可知，不同溶劑提取物中含有的物質種類和含量存在明顯差異，在ME、EE和AE中檢測到全部8種物質，EAE未檢測到異槲皮苷，TE中檢測到6種物質，而PE中只檢測到原花青素B2、表兒茶素和金絲桃苷3種物質。總的來看，每種提取物中，表兒茶素和原花青素B2的含量較高，其次為綠原酸、槲皮素。EE中含有最高的兒茶素，其次為ME和AE；而對于其他每種物質成分，其含量最高的被發現在ME中，其次為EE、AE、EAE、TE 和 PE。

2.3 不同提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力

山楂不同提取物的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力結果見表2。

表2 不同溶劑提取物的自由基清除能力Table 2 DPPH and ABTS free radicals scavenging ability of different solvent extracts

不同提取物對DPPH自由基和ABTS自由基具有不同程度的清除作用，在測定濃度范圍內均呈線性關系。ME和EE清除DPPH自由基能力顯著強于其它提取物，其 IC50值分別為 2.43、3.22 mg/mL，其次為 AE、EAE、TE和PE。不同提取物對ABTS自由基的清除能力與DPPH自由基的清除能力相一致，清除能力由強到弱依次為 ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE。

2.4 山楂提取物的鐵還原能力

山楂不同溶劑提取物的鐵還原能力測定結果見圖2。

圖2 不同溶劑提取物鐵還原能力Fig.2 FARP value of different solvent extracts

由圖2可以看出，提取溶劑對提取物的鐵還原能力有顯著的影響。ME的鐵還原能力最強，為2.88 mmol Fe（II）/g，其次為 EE（2.17 mmol Fe（II）/g）和AE（0.91 mmol Fe（II）/g）；EAE、TE 和 PE 的鐵還原能力沒有顯著差異，分別為 1.74、1.12、1.08 mmol Fe（II）/g，遠遠低于其它提取物。

2.5 不同提取物對蛋白質氧化損傷的保護效果

Cu2+、Fe2+、Fe3+等金屬離子可以催化雙氧水，產生能與氨基酸反應的·OH[16]，本試驗通過Cu2+-H2O2體系產生·OH，誘導蛋白質的氧化損傷，考察山楂提取物對蛋白質損傷的保護作用，試驗結果見圖3。

圖3 不同溶劑提取物對蛋白質損傷的保護效果Fig.3 Protective effects of different solvent extracts on protein oxidative damage

在蛋白質氧化損傷的反應體系中，提取物可能會通過直接清除羥基自由基來保護蛋白質[17]。不同溶劑提取物處理組中，ME對蛋白質的保護率達到了55.78%，其次為EE、AE對蛋白質的保護率分別為53.12%和37.25%，EAE對蛋白質的保護率為25.94%，而TE和PE對蛋白質的氧化損傷基本上起不到保護作用。

2.6 不同提取物對DNA氧化損傷的保護效果

天然存在的pBR322 DNA呈超螺旋結構，受外界因素損傷導致其中一條鏈斷裂變為開環形，兩條鏈斷裂變為線型，通過檢測pBR322 DNA構象的改變，可反映DNA氧化損傷程度[18-19]。山楂提取物對DNA損傷的保護作用結果見圖4。

由圖4可知，ME、EE對DNA的氧化損傷具有較好的保護作用，保護率分別達到了74.14%、63.17%，AE對DNA氧化損傷的保護率為31.35%，EAE為17.06%，TE和PE對DNA氧化損傷沒有保護作用，保護率僅為2.41%和0.43%。

2.7 總多酚、黃酮含量與生物活性的相關性分析

山楂提取物中總多酚、總黃酮含量與其生物活性的相關性分析結果見圖5。

圖4 不同溶劑提取物對DNA損傷的保護效果Fig.4 Protective effects of different solvent extracts on DNA oxidative damage

圖5 總多酚、黃酮及生物活性的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of total polyphenols，flavonoids and biological activities

不同溶劑提取物中總酚含量、黃酮含量與其抗氧化能力、蛋白質和DNA氧化損傷保護能力呈正相關，相關系數均不小于0.794，且相關性顯著（P＜0.05）。這些結果與以前的一些報道相一致[14，20-21]，說明山楂提取物總多酚、黃酮含量的多少可以反映其抗氧化能力及其對蛋白質和DNA氧化損傷保護能力的強弱。除此之外，提取物的抗氧化能力、蛋白質和DNA氧化損傷保護能力之間的相關性亦呈顯著正相關，說明這幾種方法適合測定并能綜合反應山楂提取物的抗氧化能力

3 結論

本研究比較了山楂不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量，隨著提取溶劑極性的增強，提取物中總多酚和總黃酮的含量隨之增加，即ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE，表明山楂中極性多酚的含量較高。

分析測定了提取物的組成成分、體外生物活性及其相關性。通過5種評價體系可知，山楂的不同溶劑提取物中ME、EE和AE表現出較好的抗氧化能力及其對蛋白質和DNA氧化損傷保護能力，而EAE、TE和PE的生物活性相對較弱，山楂提取物中總多酚和總黃酮含量與其生物活性具有顯著正相關性。本試驗通過研究不同溶劑對山楂提取物活性成分及其生物活性的影響，為山楂資源的深度開發提供參考，但其活性單體的分離純化、生物活性及其之間相互作用，均有待于進一步深入研究和探討。