河南產(chǎn)白蒿精油的化學成分分析及抑菌活性研究

（鄭州師范學院化學化工學院，河南鄭州450044）

食品腐敗是一個全球性的問題，數(shù)以百萬計的人遭受著由食物傳播的痛苦感染。因此，迫切需要尋找新型、有效、安全的抗菌藥物。植物精油能以接觸或熏蒸的方式在食物周圍形成抑菌氛圍而達到防腐保鮮[1-2]，是人類開發(fā)綠色抗氧化劑和抗菌防腐劑的重要原料。蒿類植物在地球上分布廣泛，氣味濃郁，富含精油，多數(shù)具有殺菌滅蟲之功效，在醫(yī)療、保健、食品保鮮、化妝品等領域具有潛在的應用前景。如吳克剛等[3]研究了芳香植物精油對食品常見腐敗微生物抗菌活性作用，試驗表明，腐敗微生物對植物精油表現(xiàn)出不同的敏感性；崔惠敬等[4]研究了植物精油對大菱鲆弧菌的體外和體內(nèi)抗菌活性，發(fā)現(xiàn)14種待測植物精油對大菱鲆弧菌具有不同程度的抑制效果，其中肉桂醛的抗菌活性最強；Zahra M等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃連木揮發(fā)油重要成分a-蒎烯對消化性潰瘍有一定的保護作用；段偉麗等[6]研究表明，艾蒿精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有抑制作用。白蒿（Herba artimisiae sieversianae）又稱茵陳、大籽蒿、豬毛蒿等。醫(yī)學研究表明白蒿具有清熱解毒、抗菌消炎、祛濕消腫、抗氧化、抗艾滋病等功效[7]。

本研究以河南產(chǎn)白蒿植物為原料，采用水蒸氣蒸餾法提取精油，通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR） 和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 聯(lián)用儀對精油成分進行了分析，并就白蒿精油對大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性進行了探究，旨在尋求一種綠色安全、無污染的食品防腐劑，也為白蒿中藥資源的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

TFT-1310氣相色譜-質(zhì)譜儀器：賽默飛世爾科技有限公司；FTIR-650紅外光譜儀器：津港東科技發(fā)展股份有限公司；LX-07A萬能高速粉碎機：紅光工貿(mào)有限公司；FA116分析天平：上海海康電子儀器；DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海景洪試驗設備有限公司；DHP-2150電熱恒溫培養(yǎng)箱：鄭州生元儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋：松下健康醫(yī)療器械株式會社。

白蒿原料：白蒿植物地上部分，于6月初采于河南信陽光山，陰干保存，粉碎備用；大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌種：鄭州師范學院生命科學學院微生物試驗室；乙醚、丙酮、二甲基亞砜、氯化鈉、無水硫酸鈉試劑均為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司；瓊脂、蛋白胨、牛肉膏等：上海國藥試劑集團；試驗用蒸餾水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 白蒿精油的提取

將采集的新鮮白蒿材料去桿陰干，粉碎成末，準確稱量10份，每份30 g，分別放進500 mL的圓底燒瓶里，以料液比1∶10（g/mL）的量加入蒸餾水，室溫（20℃）浸提8 h后加入1g氯化鈉，幾粒沸石，采用簡易水蒸氣蒸餾裝置（燒瓶、恒壓漏斗、球形冷凝管）對白蒿精油進行提取，每隔10 min轉(zhuǎn)移一次餾出液，直至恒壓漏斗上層無油狀物為止，約回流2 h。將餾出液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，加入4 mL乙醚萃取3次，醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后水浴加熱蒸除乙醚，即得精油，稱重。置于4℃冰箱里密封保存。

1.2.2 白蒿精油的成分分析

將提取出來白蒿精油用丙酮稀釋后，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術對精油成分進行測定分析。色譜條件：色譜柱為ZB-5熔融石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；進樣方式：分流比 1 ∶10，進樣量：1 μL。程序升溫柱溫：初始溫度60℃，保留3 min；以6℃/min升至260℃并保持10 min。質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊離子源（electron impact ion source，EI），電子能量 70 eV，離子源溫度200℃。掃描范圍：30 amu～500 amu，掃描速率0.2 scans/s。用計算機譜庫NIST進行檢索。

采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對獲得的精油樣品進行表征。檢測條件為：KBr壓片法，測定范圍4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.3 白蒿精油的抑菌試驗

1.2.3.1 菌懸液的制備

培養(yǎng)基的制備：在大燒杯中加入250 mL蒸餾水、1%的蛋白胨、0.3%牛肉膏、0.5%氯化鈉，1.5%瓊脂粉，加熱攪拌均勻。將配置好的培養(yǎng)基分裝在錐形瓶中，用封口膜封好，放入高壓蒸汽滅菌鍋中在120℃下滅菌2 h。

細菌接種及擴培：在紫外燈滅菌30 min，通風10 min的超凈工作臺上，將培養(yǎng)基倒入無菌空白培養(yǎng)皿上，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種環(huán)將大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌菌株分別接種于上述培養(yǎng)基中，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將活化后的細菌用接種環(huán)，接種于新的培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，使用平板計數(shù)法調(diào)整濃度為 106CFU/mL～107CFU/mL，即得菌懸液[8]，備用。

1.2.3.2 白蒿精油抑菌劑的制備

白蒿精油以體積分數(shù)為5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）水溶液為溶劑，對其進行溶解稀釋，配制濃度分別為 100、52、26、17 mg/mL 的精油抑菌劑，并設置溶劑空白對照試驗。

1.2.3.3 抑菌性測定

采用濾紙片法進行抑菌試驗的測定。具體操作如下：用移液槍分別吸取100 μL菌懸液到培養(yǎng)皿中，使用滅菌涂布棒將細菌涂布于培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子，夾取浸有白蒿精油抑菌劑的3片濾紙片置于含菌平板上，每個平板有3個樣品，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，同時設置溶劑空白試驗，通過測定抑菌圈直徑以評估抑菌活性大小。

1.2.3.4 最低抑菌濃度的測定

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定參照文獻[6]，采用平板法。先在試管中以5%二甲基亞砜溶劑稀釋配制一系列濃度的白蒿精油溶液，精油濃度范圍在 0.5 μL/mL～50 μL/mL，每個試管中加入50 μL上述配制的菌懸液。以體積分數(shù)5%的二甲基亞砜為對照，37℃培養(yǎng)24 h，每管取100 μL涂布，培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長狀況，以平板無細菌生長的精油體積分數(shù)作為最低抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 白蒿精油的紅外光譜分析

以KBr壓片，采用FT-IR對獲得的白蒿精油樣品進行表征，測定范圍4 000 cm-1～500 cm-1，紅外光譜如圖1所示。

圖1 白蒿精油紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

由圖1可知，3 421 cm-1處較強的吸收峰為羥基O-H的伸縮振動，說明白蒿精油中含有較多的醇類物質(zhì)；2 921 cm-1處為CH3和CH2的C-H伸縮振動吸收峰，1 631 cm-1處為C=C的伸縮振動吸收，1 600 cm-1～1 450 cm-1處的多重峰為苯環(huán)骨架的特征吸收峰，提示白蒿精油中含有較多的揮發(fā)性烯烴及芳香類有機物。

2.2 白蒿精油的GC-MS分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術對白蒿精油化學成分進行了檢測，得到白蒿精油的總離子流如圖2。

圖2 白蒿精油氣相色譜-質(zhì)譜分析總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion current chromatogram of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

由圖2可知，白蒿精油成分較復雜，從白蒿精油中分離出約63種組分。通過計算機NIST-MS譜庫自動檢索各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對結果參考有關標準圖譜比對和人工分析，以面積歸一化法計算出精油各組分的相對含量，其主要化學成分及含量見表1。

由表1和圖2可知，共鑒定出河南產(chǎn)白蒿精油中的主要化合物26種，占精油總含量的85.05%，主要成分有氧化石竹烯（15.24%）、鐮葉芹醇（14.34%）、大根香葉三烯-1-醇（8.90%）、桉油烯醇（6.61%）、棕櫚酸（5.72%）、α-畢橙茄醇（5.19%）、香橙烯氧化物（3.71%）、亞麻酸（2.64%）、藍桉醇（2.58%）等。從精油化學成分的類別上看，白蒿精油含有較多的醇類、烯烴成分，這與紅外光譜圖得出的結論一致。據(jù)文獻調(diào)研，鐮葉芹醇、大根香葉三烯-1-醇、桉油烯醇等物質(zhì)具有光譜抗菌的作用，其中鐮葉芹醇還有抗腫瘤、抗凝血、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等醫(yī)藥功效。白蒿精油的化學成分及其含量也與其它文獻報道的結果相差較大，劉群等[9]從長春野生白蒿中提取的揮發(fā)油主要化學成分為1，8-桉葉油素、反-丁香烯、順-丁香烯和樟腦等；Suleimenov E M等[10]對采自哈薩克斯坦的白蒿精油進行分析，發(fā)現(xiàn)其主要含有月桂烯、桉油精、芳樟醇、對傘花烴等；李海亮等[11]從其白蒿精油中共鑒定48種化合物，其中紅沒藥醇、蘭香油奧2種組分總含量占精油總量的50%以上。這些差異可能與白蒿的產(chǎn)地、氣候、生長環(huán)境以及提取條件等因素有密切關系。

表1 白蒿精油化學成分含量表Table 1 Chemical composition of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae

2.3 白蒿精油抑菌試驗結果分析

按照1.2.3中抑菌性測定方法，以5%二甲基亞砜溶劑空白試驗為參照，采用濾紙片法進行抑菌活性測定，以抑菌圈直徑大小評估抑菌活性。抑菌圈直徑大于20 mm時為極敏；16 mm～20 mm為高敏；11 mm～15 mm為中敏；8 mm～10 mm為低敏；小于8 mm為不敏感[12]。5%二甲基亞砜溶劑及不同濃度的白蒿精油抑菌劑對大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌試驗結果見表2。

表2 白蒿精油對4種待試菌的抑菌活性Table 2 Antimicrobial activities of essential oil from Herba artimisiae Sieversianae against 4 tested microbes

由表2可知，5%二甲基亞砜溶劑對4種待測細菌的抑菌能力較弱，抑菌圈直徑基本接近7 mm，最大僅為7.5 mm。其抑菌效果見圖3。

圖3 二甲基亞砜溶劑抑菌效果圖Fig.3 Antibacterial activities of DMSO solvent against 4 tested microbes

二甲基亞砜溶劑對四聯(lián)球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑菌性，對蠟樣芽孢桿菌有微弱的抑菌性，因此選取5%二甲基亞砜作為精油的溶解試劑可行。

通過對表2數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，白蒿精油對大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌4種受試菌均有較強的抑菌作用，同一濃度的白蒿精油抑菌液對不同的菌株抑菌能力不同。濃度為100 mg/mL的精油抗菌效果如圖4所示。

白蒿精油對枯草芽孢桿菌抗性效果最好，100mg/mL濃度的抑菌試驗中抑菌圈直徑可達22.20 mm，對蠟樣芽孢桿菌抗性稍差，抑菌圈為15.50 mm。

不同濃度的精油抑菌液抑菌效果對比發(fā)現(xiàn)，隨著精油抑菌液濃度的升高，抑菌圈直徑增大，抑菌能力增強，如圖5所示。

圖4 同一濃度（100 mg/mL）白蒿精油對不同細菌的抑菌效果圖Fig.4 Antimicrobial activities of essential oil with 100 mg/mL from Herba Artimisiae Sieversianae against 4 tested microbe

圖5 不同濃度的白蒿精油對四聯(lián)球菌的抑菌效果圖Fig.5 Antimicrobial activities of essential oil with different concentrations from Herba artimisiae Sieversianae against Micrococcus tetragenus

17 mg/mL濃度的白蒿精油對四聯(lián)球菌的抑菌圈直徑僅為9.00 mm，而濃度為100 mg/mL時，抑菌圈直徑達到20.67 mm，為前者的2.29倍。

為了進一步了解白蒿精油對4種受試菌的抑菌效果，就白蒿精油對4種受試菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進行了測定，結果見表3。

由表3可發(fā)現(xiàn)，不同菌種對白蒿精油的抗性不同，最低抑菌濃度也不同。其中精油對枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度最小，僅為2.5 μL/mL；對四聯(lián)球菌和大腸桿菌最低抑菌濃度均為5 μL/mL；對蠟樣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為10 μL/mL?？梢?，極少量的白蒿精油即可抑制細菌生長，在實際應用中可大大節(jié)省成本。

表3 白蒿精油對供試菌種的最低抑菌濃度Table 3 Minimal inhibitory concentrations of essential oils from Herba artimisiae Sieversianae against 4 tested microbes

3 總結與展望

本研究采用水蒸氣蒸餾法提取白蒿植物精油，采用紅外光譜（FT-IR）及氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術對精油化學成分進行檢測和分析，共鑒定出河南產(chǎn)白蒿精油中的主要化合物26種，占精油總含量的85.05%，主要成分有氧化石竹烯、鐮葉芹醇、大根香葉三烯-1-醇、桉油烯醇、棕櫚酸、α-畢橙茄醇、香橙烯氧化物、亞麻酸、藍桉醇等。

通過對河南產(chǎn)白蒿精油的抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，精油對大腸桿菌、四聯(lián)球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌4種受試細菌均有一定的抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌抑制活性最強而對蠟樣芽孢桿菌較弱，在試驗濃度下，對枯草芽孢桿菌最大抑菌圈直徑達到了22.20 mm，顯示了極敏性。抑菌試驗結果提示白蒿精油含有較強抑菌活性的化學成分，這對于白蒿藥材的研發(fā)及天然食品防腐劑的開發(fā)提供了理論參考。

隨著社會的高速發(fā)展以及人們對生活品質(zhì)要求的不斷提高，越來越多人的更加傾向選擇天然產(chǎn)物添加的產(chǎn)品。蒿類植物種類豐富，遍布世界各地，取材方便，價格低廉，其植物精油香氣濃郁，可作香料，又具有抗菌作用，在未來的食品、醫(yī)療領域?qū)⒕哂芯薮蟮膽们熬啊?/p>