酸棗仁皂苷提取工藝的優(yōu)化及固體飲料產(chǎn)品的研制

（山西中醫(yī)藥大學制藥與食品工程學院，山西晉中030619）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗的干燥種子，是一種藥食同源的常見中藥，具有催眠、鎮(zhèn)靜等功效，在臨床中具有良好的治療與改善失眠狀況的效果，酸棗仁也是改善睡眠保健食品開發(fā)的常用主要原料之一[1]。酸棗仁中的活性成分包括皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸等，其中酸棗仁皂苷類是發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的主要物質(zhì)[2]。目前已從酸棗仁中分離出的皂苷類化合物有酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、酸棗仁皂苷A1、酸棗仁皂苷B1、原酸棗仁皂苷A、原酸棗仁皂苷B、乙酰酸棗仁皂苷B等，其中以酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的含量最多。鑒于酸棗仁皂苷的良好改善睡眠功效，致力于提高酸棗仁皂苷提取率的工藝優(yōu)化方法一直廣受關注[3-6]，所涉及到的提取方法有乙醇回流法、超聲法、微波法、酶輔助法等。不同的提取方法具有不同的特點，如乙醇回流法經(jīng)濟、簡單，但提取時間長，提取率不高；酶法提取率高，但往往需要與其他提取方法復合使用，提取程序稍顯復雜；相較而言，超聲法與微波法操作簡單，提取時間短而提取率較高，是一種省時高效的提取方法。通過進一步優(yōu)化酸棗仁皂苷的提取工藝，可為后續(xù)基于酸棗仁提取物的保健產(chǎn)品開發(fā)提供質(zhì)量一致、活性成分得率較高的原料，具有重要的應用價值。

目前市場中改善睡眠的保健產(chǎn)品主要是以酸棗仁粉末為原料，相應產(chǎn)品多采用口服液、膠囊等藥物制劑的形式[1]，以食品形態(tài)面市的產(chǎn)品在該領域比重很小，因此亟需開發(fā)新型的可用于改善睡眠的酸棗仁精深產(chǎn)品。固體飲料是指含水量很低的粉末、顆粒、片狀或塊狀物，用水沖調(diào)即可飲用的一種食品，具有方便、快捷等優(yōu)點，深受消費者喜愛[7]，市場需求量巨大。本試驗采用超聲輔助提取酸棗仁中活性物質(zhì)，通過優(yōu)化酸棗仁皂苷的提取工藝，以期開發(fā)以酸棗仁皂苷提取物為主要成分的固體飲料，一則豐富市場中改善睡眠產(chǎn)品的形式，二則拓寬酸棗仁資源的產(chǎn)業(yè)鏈，為相關從業(yè)人員的發(fā)展創(chuàng)收提供新出路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗仁：亳州成源中藥飲片有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa （Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子；酸棗仁皂苷A對照品：上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；麥芽糊精、檸檬酸：河南萬邦實業(yè)有限公司；木糖醇：河南圣斯德實業(yè)有限公司；蔗糖脂肪酸酯：河南千志商貿(mào)有限公司；食品級乙醇：河南鑫河陽酒精有限公司；分析級乙醇：天津市進豐化工有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AR423CN型電子天平：美國奧豪斯儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；ULTRA-3600型紫外-可見分光光度計：北京普源精電科技有限公司；SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SB-5200DT型超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；ACQUITY UPLC/Q-TOF Premier型液質(zhì)聯(lián)用儀（配有MassLynx V4.1軟件工作站）：美國Waters公司。

1.3 酸棗仁總皂苷提取物的制備

1.3.1 提取流程

酸棗仁→粉碎→石油醚脫脂→干燥、過篩→加入提取試劑浸泡30 min→超聲提取→過濾→濃縮→提取物浸膏

1.3.2 提取工藝優(yōu)化的單因素試驗

取脫脂酸棗仁粉末5 g，在固定超聲功率為200 W的條件下，分別研究乙醇體積分數(shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）]、超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃） 和超聲時間（15、25、35、45、55 min）4個單因素對酸棗仁皂苷提取率的影響，其中各因素的固定水平為乙醇體積分數(shù)70%、液料比 25∶1（mL/g）、超聲溫度 30℃、超聲時間 25 min。

將提取物浸膏用蒸餾水復溶，加入1倍體積的水飽和正丁醇萃取，取正丁醇相蒸干后用甲醇定容至50 mL作為供試溶液。以酸棗仁皂苷A為標準品，參照文獻所述的分光光度法進行酸棗仁皂苷含量的測定[8]，以每克酸棗仁粉末中的酸棗仁皂苷含量表示為提取量（mg/g）。

1.3.3 提取工藝的響應面優(yōu)化

為進一步研究各單因素對提取率的交互影響，以酸棗仁皂苷提取量為指標，在單因素試驗基礎上，固定超聲溫度為50℃，確定如表1所示的因素和水平，采用響應面法確定最優(yōu)的提取工藝。

表1 響應面設計試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels for response surface design

1.4 酸棗仁提取物的液質(zhì)分析

利用超高液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF/MS）對酸棗仁提取物進行成分分析[9]。色譜條件：采用Waters BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，以含0.1%甲酸的水溶液（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.5 min，5%B；0.5 min～2 min，5%～15%B；2 min～4 min，15%～20%B；4 min～7 min，20%～35%B；7 min～10 min，35%～60%B；10 min～12 min，60%～85%B；12 min～13 min，85%～100%B；13 min～16 min，100%B；16 min～16.5 min，100%～5%B；16.5 min～18 min，5%B），流動相流速為 0.4 mL/min。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正/負離子模式，離子源溫度115℃，毛細管電壓2.8 kV，掃描范圍m/z 50～1 500，采集時間 0～18 min。

1.5 酸棗仁提取物固體飲料的制備

1.5.1 工藝流程

酸棗仁提取物浸膏→加入適宜輔料→混勻→干燥→粉碎、過篩→混合其他配料→成品

1.5.2 單因素試驗

取2 g酸棗仁提取物浸膏，在固定輔料蔗糖脂肪酸酯添加量為0.02 g的前提下，分別研究麥芽糊精用量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g）、木糖醇用量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g）和檸檬酸用量（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g）對產(chǎn)品感官的影響，其中各因素的固定水平為麥芽糊精0.4 g、木糖醇0.6 g和檸檬酸0.06 g。產(chǎn)品感官評價是將產(chǎn)品以10倍水沖調(diào)后，由10名評價人員按照表2所示的評定標準（滿分為100分）進行評分后獲得。

表2 感官評價標準Table 2 The standard of sensory score

1.5.3 正交試驗

為進一步優(yōu)化產(chǎn)品配方，在單因素試驗基礎上，以感官評價為指標，進行三因素三水平的正交試驗，得到酸棗仁提取物固體飲料的最佳配方，因素水平表見表3。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test

1.6 酸棗仁提取物固體飲料的理化和衛(wèi)生指標分析

測定固體飲料的水分含量（參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法），分析其菌落總數(shù)（參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》）和大腸菌群指標（參照GB 4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》）。

2 結果與分析

2.1 酸棗仁提取物的制備工藝

2.1.1 單因素試驗

各單因素對酸棗仁皂苷提取量的影響見圖1。

圖1 提取工藝的單因素試驗Fig.1 Single factor tests of the extraction process

由圖1可知，適當提高提取劑中乙醇的濃度可明顯增加酸棗仁皂苷的提取量，且乙醇體積分數(shù)為70%時提取量最大，繼續(xù)增大乙醇濃度提取率會呈下降趨勢。這可能與酸棗仁中各類物質(zhì)的溶解度有關，過高的乙醇體積分數(shù)可能更利于其他非皂苷類物質(zhì)的溶出，從而表現(xiàn)為皂苷提取量的下降。液料比越大越利于酸棗仁皂苷的提取，這是因為提取試劑的增多可加大傳質(zhì)動力，促進固相酸棗仁中皂苷類物質(zhì)向液相提取試劑中的遷移[10]，因而起初料液比與提取量呈正相關，且液料比為25∶1（mL/g）時提取量最高，之后繼續(xù)增大液料比提取量未出現(xiàn)明顯變化，這可能是由于液料比25∶1（mL/g）時固相中皂苷類物質(zhì)的溶出已充分，因而即使再增加提取試劑的用量也并未提取到更多的目標物，因而表現(xiàn)為提取量的幾乎不變。超聲溫度對提取量的變化趨勢類似于乙醇體積分數(shù)，但影響整體偏小，且超聲溫度為50℃時提取量最高，溫度高于50℃反而不利于提取，這是因為適當?shù)脑黾訙囟瓤杉涌旆肿舆\動，促進傳質(zhì)，利于提取；然而當溫度過高時，可能會導致三萜類化合物的結構變化[11]，進而影響到其比色檢測，因此提取量呈下降趨勢，選取50℃作為酸棗仁皂苷的最佳超聲提取溫度。由圖1d可知，超聲時間越長，提取量越大，時間為35 min時提取量最高，繼續(xù)增加提取時間并未提高提取量，說明35 min時皂苷的溶出已基本完全，因而即使延長提取時間也不會提高提取量。

2.1.2 響應面優(yōu)化

由于超聲溫度對酸棗仁皂苷提取量的影響整體較小，該部分僅考察了乙醇體積分數(shù)、液料比與超聲時間3個因素的交互作用，17組試驗結果如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Results of Box-Behnken experimental design

對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合得回歸模型方程為：提取率=7.02+0.27A+0.24B+0.13C-0.041AB+0.22AC-0.093BC-1.22A2-0.38B2-0.32C2。回歸方差分析結果見表5。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation

表5顯示模型顯著，失擬項不顯著，模型可解釋97.55%的響應值變化（R2adj=0.975 5），表明模型成立。F值反映出三因素對響應值影響的強弱順序為：A＞B＞C。一次項A和B對模型的影響極顯著，一次項C對模型的影響顯著，二次項A2、B2和C2均極顯著，交互項AC為顯著，說明A、C兩因素之間存在交互效應。各因素對酸棗仁皂苷提取量的響應面圖見圖2。

圖2 各因素對酸棗仁皂苷提取量的響應面圖Fig.2 Response surface diagrams of the factors on the extraction amount of jujube seed saponins

圖2的響應面圖可進一步對兩因素之間的交互效應作更直觀的反映，響應面的坡度反映各因素變化對響應值的影響，而等高線的形狀及疏密程度則反映了兩因素交互效應的強弱。如圖2a中等高線較密集但接近圓形，而圖2c中等高線稀疏，說明乙醇體積分數(shù)與液料比以及液料比與超聲時間兩因素之間交互作用不明顯，而圖2b中等高線呈橢圓形且曲線較密集，說明乙醇體積分數(shù)與超聲時間兩因素交互作用明顯，這與方差分析結果一致。根據(jù)二次多元回歸方程的擬合，得到最佳的提取工藝預測值為：乙醇體積分數(shù)71.25%，液料比 26.43 ∶1（mL/g），超聲時間 37.12 min，最佳提取量為7.100 0 mg/g。根據(jù)實際情況，對條件進行調(diào)整，在乙醇體積分數(shù) 70%，液料比 25 ∶1（mL/g），超聲時間37 min，超聲溫度50℃的操作條件下進行3次重復提取驗證，得到平均提取量為7.094 5 mg/g，與預測值相差不大，說明模型可用于酸棗仁皂苷的提取。

2.2 酸棗仁提取物的液質(zhì)分析

酸棗仁提取物在正/負離子模式下的總離子流圖見圖3。

圖3 酸棗仁提取物在正離子模式和負離子模式的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of jujube seed extracts in the positive ion mode and the negative ion mode

通過分析各化合物的色譜保留時間、相對分子質(zhì)量以及碎片離子信息，并結合文獻初步推測出21個色譜峰，結果如表6所示。

提取物中包含10種三萜類（原酸棗仁皂苷A、原酸棗仁皂苷B、酸棗仁皂苷A1、酸棗仁皂苷IV、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、乙酰酸棗仁皂苷B、酸棗仁皂苷B1、麥珠子酸、24-羥基美洲茶酸）、9種黃酮類（斯皮諾素、6’’’-阿魏酰斯皮諾素、新西蘭牡荊苷、6’’’-（4""-O-吡喃葡萄糖基）-香草酰斯皮諾素、當藥黃素、6’’’-對香草酰斯皮諾素、6’’’-對羥基苯甲酰斯皮諾素、6’’-O-（3-吲哚乙酰葡萄糖）-6’’’-香草酰斯皮諾素、山茶苷B）及2種生物堿類化合物（烏藥堿、酸李堿）。這些皂苷、黃酮以及生物堿類成分均被報道具有鎮(zhèn)靜和催眠作用[14-16]，這為后續(xù)所開發(fā)產(chǎn)品的功效奠定了科學基礎。

表6 酸棗仁提取物的成分鑒定分析Table 6 Identification and analysis of the components of jujube seed extracts

2.3 酸棗仁提取物固體飲料的配方優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗結果

配方優(yōu)化的單因素試驗結果見圖4。

圖4 配方優(yōu)化的單因素試驗Fig.4 Single factor tests for formula optimization

麥芽糊精是淀粉的降解物，甜度較低，接近無味，主要影響體系的黏度，增稠作用明顯。麥芽糊精可改善產(chǎn)品的沖調(diào)性，提高速溶性。圖4a表明，隨著麥芽糊精添加量的增加，組織狀態(tài)、色澤等感官逐漸改善，但添加量過高會帶來糊精特有的味道，影響整體口感，因此初步選取0.6 g為麥芽糊精最佳用量。木糖醇是一種天然物質(zhì)，賦予產(chǎn)品甜味的同時不會增加血糖濃度，是一種理想的添加劑。圖4b表明，木糖醇的添加可有效掩蓋酸棗仁提取物的苦味，且木糖醇用量為0.8 g時對苦味的中和效果最好，繼續(xù)增加木糖醇添加量雖然產(chǎn)品沒有苦味但是會使得產(chǎn)品過甜，因此初步選取0.8 g為木糖醇最佳用量。圖4c反映了檸檬酸用量對產(chǎn)品感官的影響，可見0.04 g的檸檬酸用量時感官評分最高，此時產(chǎn)品酸甜適宜、無苦味，口感最佳；繼續(xù)增加檸檬酸添加量會使得酸甜不適中，因過酸而導致口感下降。因為酸棗仁提取物本身具有酸苦味，因此本研究所開發(fā)的產(chǎn)品中檸檬酸用量較小。

2.3.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表7。

表7 L9（34）正交試驗結果Table 7 Results of the L9（34）orthogonal experimental design

方差分析見表8。

表8 方差分析表Table 8 Results of variance analysis

由表7中極差可知，各因素對感官影響大小的順序為Z＞Y＞X，且最好的組合為X3Y2Z3，即每2 g酸棗仁提取物浸膏中添加有麥芽糊精0.8 g，木糖醇0.8 g，檸檬酸0.06 g。表8的方差分析表顯示木糖醇與檸檬酸兩個因素對感官的影響顯著，麥芽糊精影響不顯著，其原因可能是酸棗仁提取物原料本身具有酸苦味，因此可以調(diào)和苦味的木糖醇以及影響酸度的檸檬酸用量對產(chǎn)品的口感有極大影響。采用最佳條件進行3組平行試驗，產(chǎn)品入口圓潤、酸甜適中、分散性好、色澤均勻、呈淡黃色，具有酸棗仁特有的淡淡香氣，無異味，平均感官評分為87分。

2.4 酸棗仁提取物固體飲料的質(zhì)量分析

所制得固體飲料的水分含量為4%，菌落總數(shù)＜1000 CFU/g，大腸菌群未檢出，符合產(chǎn)品標準要求。

3 結論

本研究通過單因素結合響應面法優(yōu)化了酸棗仁皂苷的提取工藝，得到最佳提取工藝為：超聲功率200 W、超聲溫度為50℃、超聲時間為37 min、乙醇體積分數(shù)為 70%、液料比 25 ∶1（mL/g），提取量為 7.094 5 mg/g。采用液質(zhì)聯(lián)用對提取物成分進行了分析，推測出其中含有10種三萜類、9種黃酮類和2種生物堿類化合物，這些化合物被揭示具有鎮(zhèn)靜和催眠的功效。進而以酸棗仁皂苷提取物為原料，配以其他輔料制作了一款固體飲料，通過單因素試驗和正交分析，得到產(chǎn)品的最佳配方為：酸棗仁提取物2 g，麥芽糊精0.8 g，木糖醇0.8 g，檸檬酸0.06 g，蔗糖脂肪酸酯0.02 g。產(chǎn)品口感好，具有酸棗仁特有的風味，且食用與攜帶方便，具有良好的開發(fā)前景。