基于紅曲高產莫納可林K的固態發酵工藝條件優化

張占軍，王富花

（1.揚州市職業大學工程研究中心，江蘇揚州225009；2.揚州工業職業技術學院化學工程學院，江蘇揚州225127）

紅曲又稱“紅米”、“丹曲”、“福米”，是將紅曲霉屬真菌接種于蒸熟的大米上進行固態發酵而成的一種藥食兩用物質[1]，在我國有著上千年的生產及應用史，普遍應用在釀酒[2]、紅腐乳制造[3]、食醋生產[4]、發酵飲料[5]、肉制品[6]以及降壓降脂藥物[7]等方面。1979年日本學者遠藤章[8]從紅曲霉的次級代謝產物中分離得到了一種能有效抑制膽固醇合成的活性物質，命名為莫納可林K（Monacolin K）。1980年美國科學家Alberts[9]在土曲霉中發現了同樣具有抑制膽固醇作用的活性物質洛伐他汀（lovastatin）。由于紅曲是天然固態發酵產品，無需經過任何提純，在安全性方面更比處方藥洛伐他汀安全可靠[10]。且其發酵產物中除了含有莫納可林K之外，還有一系列洛伐他汀結構類似物、Y-氨基丁酸等生理活性物質存在，這些相關成分和莫納可林K相聯合，不僅具有協同調節血脂的功效，而且還極大地降低了純品洛伐他汀的副作用[11-13]。隨著人們對以紅曲霉開發的保健食品、保健藥品等紅曲產品的需求日益增大，深入研究如何有效提高紅曲固態發酵中莫納可林K的含量，對紅曲產品的進一步開發及應用具有深遠的意義。近年來國內外對于紅曲固態發酵高產莫納可林K，主要集中于選育高產菌種、控制環境因子和優化培養基等方面，單方面研究的較多，本研究通過結合環境因子及培養基兩方面，綜合優化提高莫納可林K的產量。

本試驗擬采用響應面優化法，以紅曲高產莫納可林K為響應值，通過考察接種量、裝料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量等因素，采用Box-Behnken中心設計法，建立并驗證相關的工藝數學模型，以期對如何有效提高紅曲固態發酵過程中莫納可林K的產量提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗菌種

煙灰色紅曲霉（Monascus buliginosus Sato）：中心實驗室收集并保存。

1.1.2 培養基

斜面培養基（PDA培養基）：馬鈴薯20 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

種子培養基：蛋白胨20 g，玉米面20 g，酵母浸膏10 g，硫酸鎂 0.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，硫酸亞鐵 0.1 g，pH 6.0蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：秈米浸泡5 h后蒸熟無夾生，取適量置于250 mL滅菌三角瓶，加玉米粉、蛋白胨各適量，于121℃，0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

Monacolin K標準品：美國Sigma公司；馬鈴薯、玉米面、秈米：市售；蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、硫酸鎂、瓊脂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵：成都市科龍化工試劑廠。甲醇、乙腈、磷酸（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DS-1高速組織搗碎機：上海標本模型廠；1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；LDZX-KBS壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 紅曲固態發酵制備方法

將紅曲霉的斜面孢子適量刮入裝有無菌水的三角瓶中，振蕩搖勻后用無菌脫脂棉過濾，稀釋至濃度約106個/mL，然后以2%的接種量接種于種子培養基中，28℃下以160 r/min搖床振蕩培養48 h。將培養好的種子液按需要的接種量接種到固態發酵培養基，變溫培養15 d即得發酵紅曲。

1.3.2 紅曲中莫納可林K的檢測方法

檢測方法參考文獻報道[14]的方法，將發酵紅曲50℃下烘干粉碎至40目，準確稱取0.5 g至50 mL容量瓶中，加甲醇超聲提取1 h后4 000 r/min離心10 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾后經高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測并根據Monacolin K標準曲線計算莫納可林K含量（mg/g）。

色譜條件：ZORBAX 300SB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為乙腈 ∶水 ∶0.5%磷酸=60 ∶35 ∶5（體積比），柱溫30℃，檢測波長為238 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量 20 μL。

1.3.3 單因素試驗

進行一系列單因素試驗，在采用變溫發酵（前3 d 30℃，后12 d 26℃），發酵時間15 d固定的條件下，選取接種量、裝料量、碳源添加量、氮源添加量等四個因素分析其對紅曲固態發酵莫納可林K產量的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗確定的各變量范圍，選取接種量（A）、裝料量（B）、玉米粉添加量（C）和蛋白胨添加量（D）為自變量，莫納可林K產量為響應值，通過Design Expert 8.0.6軟件，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，進行4因素3水平的響應面分析試驗，同時對試驗數據進行回歸分析，預測高產莫納可林K的固態發酵工藝最佳條件。試驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計因素和水平Table 1 Variables and levels in the three-level，three-variable Box-Behnken experimental design

1.3.5 數據處理方法

單因素試驗數據測定3次，以Mean±SD方式表示，響應面試驗采用Design Expert 8.0.6軟件進行結果分析，通過SPSS 22.0軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種量對紅曲霉產莫納可林K的影響

適宜的接種量對于紅曲霉的正常生長代謝是至關重要的。在裝料量30 g/250 mL、玉米粉添加量1%、蛋白胨添加量1%的條件下進行變溫發酵，接種量對紅曲霉產莫納可林K的影響如圖1所示。

圖1 接種量對紅曲霉產莫納可林K的影響Fig.1 Effects of different inoculum size on the yield of Monacolin K

由圖1可知，在接種量達到15%之前，隨著接種量的增加，莫納可林K的產量也在增加，接種量達15%時，莫納可林K的產量最高，為9.25 mg/g。此后繼續增大接種量對莫納可林K的產生反而起抑制作用。可能原因是較大的接種量有利于紅曲霉產生更多的代謝產物，但如果接種量過大，將導致菌體生長過快而不利于代謝產物的形成，同時代謝產物的積累對發酵過程產生反饋抑制作用。另一方面，代謝產物的不斷形成還可能增大發酵培養基黏度，從而妨礙傳質過程，最終影響菌體生長代謝。因此選擇最佳接種量為15%。

2.1.2 裝料量對紅曲霉產莫納可林K的影響

裝料量的大小影響到紅曲霉生長代謝過程中的散熱與供氧，因而與莫納可林K的生成有重要關系。在接種量10%、玉米粉添加量1%、蛋白胨添加量1%的條件下進行變溫發酵，裝料量對紅曲霉產莫納可林K的影響如圖2所示。

圖2 裝料量對紅曲霉產莫納可林K的影響Fig.2 Effects of different loading volume on the yield of Monacolin K

圖2表明，在裝料量為30g/250mL時，莫納可林K的產量達到最大值7.26mg/g。此后再增大裝料量，莫納可林K的產量開始下降。更大的裝料量對莫納可林K的生成起到了抑制作用，這可能是由于發酵過程中紅曲霉的生長代謝活動導致發酵基質黏度變大，通透性降低，影響了散熱進程，造成物料內部溫度升高，進而影響到代謝產物的生成。因此選擇最佳裝料量為30 g/250 mL。

2.1.3 玉米粉添加量對紅曲霉產莫納可林K的影響

文獻報道[15]在紅曲霉發酵過程中以玉米粉作為碳源要優于葡萄糖、可溶性淀粉等其他碳源。主要是由于玉米粉作為有機碳源，營養豐富全面，有利于紅曲霉前期快速生長。在接種量10%、裝料量30 g/250 mL、蛋白胨添加量1%的條件下進行變溫發酵，玉米粉添加量對紅曲霉產莫納可林K的影響如圖3所示。

圖3 玉米粉添加量對紅曲霉產莫納可林K的影響Fig.3 Effects of different quantity of corn meal on the yield of Monacolin K

從圖3可以看出，隨著玉米粉添加量的增加，莫納可林K的產量也逐漸升高。當玉米粉的添加量達到3%時，莫納可林K的產量達到最大的8.66 mg/g。而當玉米粉添加量繼續增加時，莫納可林K的產量反而下降，這表明過大的添加量并不利于莫納可林K的產量的增大。原因在于玉米粉本身黏度較大，添加量越多，通氣量降低，導致生物量的積累下降從而使紅曲霉的生長及代謝產物的生成受到了一定的抑制。因此選擇玉米粉的最佳添加量為3%。

2.1.4 蛋白胨添加量對紅曲霉產莫納可林K的影響

文獻報道[16]蛋白胨是紅曲菌產Monacolin K的最佳氮源。接種量10%、在裝料量30 g/250mL、玉米粉添加量1%的條件下進行變溫發酵，蛋白胨添加量對紅曲霉產莫納可林K的影響如圖4所示。

圖4 蛋白胨添加量對紅曲霉產莫納可林K的影響Fig.4 Effects of different quantity of peptone on the yield of Monacolin K

圖4表明，隨著蛋白胨添加量的增加，莫納可林K的產量也逐漸升高。當蛋白胨的添加量達到2%時，莫納可林K的產量達到最大的7.91 mg/g。因此選擇蛋白胨的最佳添加量為2%。

2.2 響應面法對高產莫納可林K的固態發酵工藝條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計與結果

在對紅曲霉產莫納可林K的影響的單因素試驗基礎上，利用Design Expert軟件進行四因素三水平的響應面分析方法進行發酵條件的優化，試驗方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken設計模型及試驗值Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values

續表2 Box-Behnken設計模型及實驗值Continue table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values

2.2.2 紅曲固態發酵產莫納可林K回歸模型的建立及方差分析

利用Design Expert軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到紅曲固態發酵莫納可林K產量對以上4個因素的回歸方程為：

莫納可林K產量=10.88+0.68A+0.62B+0.47C+0.23D+0.61AB+0.23AC+0.045AD+0.098BC-0.27BD+0.21CD-1.13A2-0.73B2-0.88C2-0.24D2

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

該模型的確定系數為R2=0.971 8，模型的調整確定系數為R2adj=0.943 6。同時從表3可以看出：模型F值為34.48，p＜0.000 1，表明模型是高度顯著的，模型的失擬項p=0.072 6，表明失擬不顯著，說明該模型較穩定，能較好地預測實際紅曲霉固態發酵莫納可林K產量情況。模型一次項A（接種量）、B（裝料量）、C（玉米粉添加量）、部分交互項（AB、BD）及部分平方項（A2、B2、C2）均極顯著，一次項D（蛋白胨添加量）及平方項（D2）均顯著，表明各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.2.3 響應曲面圖分析優化

響應曲面圖是響應值對各試驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數及各參數之間的相互作用[17]。通過Design Expert軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，紅曲固態發酵過程中接種量、裝料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量4個因素之間對莫納可林K產量影響的響應面圖如圖5所示。

圖5表明，當紅曲固態發酵底物中玉米粉添加量和蛋白胨添加量一定時，當接種量位于15%～20%，裝料量在30 g/250 mL～35 g/250 mL范圍內時，兩者交互作用對紅曲固態發酵莫納可林K產量的影響最大，且極顯著（圖5a）；當裝料量和蛋白胨添加量一定時，接種量和玉米粉添加量兩者交互作用對莫納可林K產量影響的最大值位于接種量15%～20%，玉米粉添加量3%～5%區域內，兩者交互作用不顯著（圖5b）；當裝料量和玉米粉添加量一定時，莫納可林K產量最大值區域位于接種量15%～20%，蛋白胨添加量2%～3%范圍內，增加接種量對莫納可林K產量的影響明顯大于蛋白胨添加量的增加，兩者交互作用不顯著（圖5c）；當接種量和蛋白胨添加量一定時，裝料量和玉米粉添加量之間的交互作用對莫納可林K產量的影響不顯著，裝料量30 g/250 mL～35 g/250 mL，玉米粉添加量3%～5%為莫納可林K產量的最大值區域（圖5d）；當接種量和玉米粉添加量一定時，裝料量和蛋白胨添加量之間的交互作用對莫納可林K產量的影響極顯著，最大值區域位于裝料量30 g/250 mL～35 g/250 mL，蛋白胨添加量2%～3%范圍內（圖5e）；當接種量和裝料量一定時，玉米粉添加量和蛋白胨添加量之間的交互作用對莫納可林K產量的影響不顯著，增加玉米粉添加量對莫納可林K產量的影響明顯大于蛋白胨添加量的改變（圖5f）。

圖5 接種量、裝料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量等因素交互作用對莫納可林K產量影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of inoculum size，loading volume，dosage of different quantity of corn meal and different quantity of peptone on the yield of Monacolin K

2.2.4 提取參數優化及模型驗證

通過 Design Expert軟件可知，當 A＝0.50、B＝0.59、C＝0.40、D＝0.37時，Y 出現理論最大值11.37 mg/g。可得出紅曲固態發酵高產莫納可林K工藝條件為接種量17.50%，裝料量32.95 g/250 mL、玉米粉添加量3.80%和蛋白胨添加量2.37%。為驗證該模型方程的適用性，進行了6次驗證性試驗，驗證性試驗中莫納可林K產量為11.25±0.13 mg/g，與理論預測值相比較，結果表明p值=0.081＞0.05，因此可以認為采用優化工藝條件所得實驗值與理論預測值間無顯著差異，即該方程能較好的預測紅曲固態發酵過程中莫納可林K的產量。

3 結論

本研究基于紅曲固態發酵高產莫納可林K，通過單因素及響應面試驗，在發酵時間15 d，采取變溫發酵的條件下，優化了紅曲固態發酵過程中高產莫納可林K的工藝條件，得到紅曲固態發酵高產莫納可林K工藝條件為接種量17.50%，裝料量32.95 g/250 mL、玉米粉添加量3.80%和蛋白胨添加量2.37%，在此條件下，莫納可林K的產量可達到11.25 mg/g。