藥食同源植物丁香各部位抗?fàn)I養(yǎng)因子分析

劉積光，高玉梅，劉平懷，*

（1.海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南海口570228；2.海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南海口570228）

桃金娘科（Myrtaceae）丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.），其干燥花蕾是《中國(guó)藥典》2015年版中收錄的中草藥，該丁香為藥食兩用植物，是國(guó)家頒布的既是食品又是藥品的101種物品名單中的一種。近年來(lái)抗?fàn)I養(yǎng)因子逐漸受到研究者的關(guān)注，抗?fàn)I養(yǎng)因子是植物體代謝產(chǎn)生的能破壞營(yíng)養(yǎng)和阻礙其被吸收利用的物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物和機(jī)體的健康及生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不利影響[1]，人們把對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用產(chǎn)生不利影響以及使人和動(dòng)物產(chǎn)生不良生理反應(yīng)的物質(zhì)，統(tǒng)稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子[2]。抗?fàn)I養(yǎng)因子種類繁多，已知抗?fàn)I養(yǎng)因子主要有蛋白酶抑制劑、植酸、凝集素、單寧酸等[3]，其中一些抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)人體的健康也會(huì)產(chǎn)生負(fù)面作用[4]，這些物質(zhì)在食用過(guò)量時(shí)，會(huì)影響人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的吸收能力，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐芍卸綶5]。丁香作為藥食同源植物，對(duì)于其抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究目前還處于缺失狀態(tài)，本文主要分析丁香的花蕾、果實(shí)、枝和葉各部位的抗?fàn)I養(yǎng)因子成分含量，為桃金娘科丁香植物資源開發(fā)利用提供基礎(chǔ)，對(duì)丁香各部位作為食品或飼料的開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

花蕾（公丁香）：廣西藥材市場(chǎng)；果實(shí)（母丁香）：三亞藥材市場(chǎng)；丁香枝、丁香葉：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所興隆藥用植物園。

植酸鈉（99%）、木糖（98%）：上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白酶（牛胰）USP級(jí)、牛血清白蛋白（生物試劑，98%）：上海源葉生物科技有限公司；單寧酸（分析純）：天津永大化學(xué)試劑有限公司；草酸鈉（分析純）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline 1X，PBS）：美國(guó) HyClone公司。

1.1.2 設(shè)備

DHG-9071A型電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHA-C型水浴恒溫振蕩：江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F97 Pro熒光分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；CCA-1112型冷卻水循環(huán)裝置：上海愛朗儀器有限公司；Master-S plus UVF型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)：上海和泰儀器有限公司；SY-1000E多用途恒溫超聲提取機(jī)：北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司；STARTER 3100 pH計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植酸含量測(cè)定

參照GB5009.153-2016《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中植酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定，并稍加改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取丁香各部位樣品5 g，加入40 mL硫酸鈉-鹽酸提取溶液，置搖床振蕩提取4 h，提取液以8 000 r/min離心5min，上清液使用硫酸鈉-鹽酸定容至50 mL，抽濾后備用。樣品提取液使用15%TCA溶液進(jìn)行凈化[6]，取植酸提取液2 mL，加入15%TCA溶液2 mL，混勻后于4℃冰箱靜置2 h后，離心吸取上清液2 mL，使用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，蒸餾水稀釋至30 mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測(cè)定按照國(guó)標(biāo)進(jìn)行繪制和測(cè)定。

1.2.2 胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定

參照GB5009.224-2016《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。精確稱取丁香各部位樣品1 g，加入0.01 mol/LNaOH溶液50 mL，用 0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至（9.5±0.1），置4℃冰箱24 h。提取液取出放置至室溫（25℃），用水定容至100 mL。搖勻，靜置15 min，按國(guó)標(biāo)要求進(jìn)行稀釋。按照國(guó)標(biāo)方法對(duì)胰蛋白酶使用液和樣品提取液進(jìn)行抑制活性的測(cè)定。

1.2.3 植物凝集素測(cè)定

樣品制備：準(zhǔn)確稱取1g丁香各部位粉末，使用8mL 0.9%生理鹽水提取12 h，4℃8 000 r/min離心5 min，取上清液；加入2.5 g硫酸銨，4℃冰箱放置12 h；4℃8 000 r/min離心10 min后收集沉淀，使用PBS（pH 7.40）溶解，4℃8 000 r/min離心5 min，取上清液在PBS中透析12 h，之后在去離子水中透析3 h，置于聚乙二醇中濃縮得到粗凝集素[7]。

測(cè)定方法：使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。

血凝集試驗(yàn)：取離心管加適量生理鹽水后，加入新鮮雞血，搖勻，4℃8 000 r/min離心5 min，反復(fù)離心至上清液顏色透明或接近透明，去上清，收集沉淀配制1%紅細(xì)胞懸液[8]。

在96孔V型微量血凝板中加入25 μL生理鹽水，并依次加入25 μL凝集素樣品液和25μL紅細(xì)胞細(xì)胞懸液至相應(yīng)孔板中。待所有孔板全部加完，輕輕搖動(dòng)孔板使所加液體混勻。室溫（25℃）下放置30 min后觀察凝集現(xiàn)象。將反應(yīng)板45°傾斜擺放，孔底紅細(xì)胞呈現(xiàn)線狀流動(dòng)說(shuō)明未被凝集，不流動(dòng)說(shuō)明被凝集素凝集。

1.2.4 單寧酸含量測(cè)定

參照GB/T27985-2011《飼料中單寧的測(cè)定分光光度法》進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取丁香各部位1.5 g，加入50 mL 50%丙酮溶液，密封置于振蕩儀上振蕩40 min后靜置，經(jīng)真空抽濾后備用。配置單寧酸溶液系列濃度 為 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mg/L，顯色后于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)國(guó)標(biāo)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 草酸含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線：取五支比色管按順序加入2mL0.5mg/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)液，20 mL鹽酸氯化鉀緩沖液，1.2 mL 0.5%磺基水楊酸后并搖勻[9]。分別加入 0、0.1、0.2、0.4、0.8 mL的草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，用水定容至25 mL，搖勻靜置顯色30 min，以水作為空白，測(cè)定OD510，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液制備：準(zhǔn)確稱取丁香各部位2.5 g，分別加入100 mL水并于75℃恒溫水浴振蕩鍋中振蕩1 h，去離子水定容至250 mL，過(guò)濾待測(cè)。

1.2.6 可溶性非淀粉多糖含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線：精準(zhǔn)移取水和 0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mg/mL木糖標(biāo)準(zhǔn)液各2 mL于比色管中。避光環(huán)境中加入10 mL顯色劑（2 g間苯三酚、10 mL無(wú)水乙醇、1 mL葡萄糖（17.5 mg/mL）、2 mL濃鹽酸和110 mL冰乙酸）[10]，沸水浴加熱25 min，冷卻至室溫（25℃），測(cè)定OD553，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品制備：準(zhǔn)確稱取樣品2 g，加入蒸餾水20 mL，于90℃水浴鍋中提取30 min，離心，沉淀加入20 mL蒸餾水重復(fù)提取2次，合并提取液濃縮至20 mL。加入60 mL pH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，加熱至95℃加入α淀粉酶，55℃時(shí)加入糖化酶，恒溫16 h，濾膜過(guò)濾后溶液濃縮至20 mL待測(cè)[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 22進(jìn)行方差齊性分析最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線使用OriginPro 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗?fàn)I養(yǎng)因子線性關(guān)系及標(biāo)準(zhǔn)曲線

植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phytic acid

粗凝集素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 粗凝集素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of coarse lectin

單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of tannic acid

草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of oxalic acid

可溶性非淀粉多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

使用Origin9.0根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得數(shù)據(jù)建立線性相關(guān)模型，均可達(dá)到0.99，說(shuō)明線性擬合度較好，線性關(guān)系較強(qiáng)，計(jì)算結(jié)果比較可靠，所得線性公式如下：

植酸：Y=-1.122 2X+0.571 7，R2=0.999 3；粗凝集素：Y=0.152 8X+0.613 5，R2=0.989 9；單寧酸：Y=0.054 2X+0.016，R2=0.9919；草酸：Y=-4.896 6X+0.681 6，R2=0.990 3；可溶性非淀粉多糖：Y=1.140 2X+0.279 4，R2=0.991 7。

圖5 可溶性非淀粉多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Soluble non-starch polysaccharide standard curve

2.2 丁香各部位抗?fàn)I養(yǎng)因子含量結(jié)果分析

丁香各部位抗?fàn)I養(yǎng)因子含量見表1。

表1 丁香各部位抗?fàn)I養(yǎng)因子含量匯總Table 1 Summary of anti-nutritional factors in various parts of Eugenia caryophyllata mg/g

由表1可知，丁香各部位在單寧酸、草酸、可溶性非淀粉多糖含量方面均具有顯著性差異，植酸含量果實(shí)與其他部位之間具有顯著性差異。粗凝集素含量果實(shí)與其他部位具有顯著性差異，果實(shí)、枝、葉之間互相具有顯著性差異，而花蕾與枝、葉則沒(méi)有顯著性差異。

丁香葉的草酸和可溶性非淀粉多糖含量為4個(gè)部位中最高，分別為3.29 mg/g和0.83 mg/g，單寧酸含量丁香花蕾含量最高為3.58 mg/g，植酸含量以花蕾部位最高40.10 mg/g，果實(shí)部位最低為33.24 mg/g。

在粗凝集素含量方面含量最高為果實(shí)部位，為1.93 mg/g。根據(jù)微凝血試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋后的凝集素提取液不具備凝血能力，4個(gè)部位均為線狀流動(dòng)，使用提取液原液進(jìn)行試驗(yàn)，花蕾和枝部位紅細(xì)胞呈明顯線狀流動(dòng)，果實(shí)和枝紅細(xì)胞雖有部分流動(dòng)，但在孔底部分產(chǎn)生明顯圓點(diǎn)。這表明果實(shí)和葉的粗凝集素在隨著含量升高的情況下會(huì)發(fā)生微弱的凝血現(xiàn)象。

2.3 胰蛋白酶抑制活性

丁香各部位胰蛋白酶抑制劑活性（typsin inhibitor activity，TIA）見表 2。

胰蛋白酶抑制劑作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子[11]，能抑制胰蛋白酶的水解作用[12]，其與胰蛋白酶的必需基團(tuán)發(fā)生不可逆反應(yīng)，形成穩(wěn)定的混合物，從而抑制胰蛋白酶與底物的結(jié)合[13]，使酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收受限，影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育與代謝[14]。丁香果實(shí)的TIA與其他3個(gè)部位之間均具有顯著性差異，而花蕾、枝、葉之間差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明丁香各部位胰蛋白酶抑制劑活性表現(xiàn)相近，果實(shí)的TIA為44.20 mg/g，與其他3個(gè)部位表現(xiàn)出顯著性差異性，其他3個(gè)部位均為41 mg/g左右。

表2 丁香各部位胰蛋白酶抑制劑活性Table 2 Inhibitory activity of trypsin inhibitors in various parts of Eugenia caryophyllata

3 討論

桃金娘科丁香作為藥食同源植物，兼具藥用和食用價(jià)值，在醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品、飼料等方面的應(yīng)用具有較大的潛力，而目前丁香集中在花蕾部位的藥用價(jià)值開發(fā)，其食用價(jià)值開發(fā)空間巨大，在食品和飼料的應(yīng)用潛力也是巨大的[15]。而抗?fàn)I養(yǎng)因子是食品和飼料開發(fā)需要注意的重要因素，抗?fàn)I養(yǎng)因子是植物體代謝產(chǎn)生的能破環(huán)營(yíng)養(yǎng)和阻礙其被吸收利用的物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物和機(jī)體的健康及生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不利影響[16]。抗?fàn)I養(yǎng)因子種類繁多，已知的主要有植酸、胰蛋白酶抑制劑、凝集素、單寧等，其中有部分對(duì)人體的健康有負(fù)面作用，會(huì)影響人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的吸收能力，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐芍卸綶17]。

文章通過(guò)對(duì)丁香各個(gè)部位的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量測(cè)定，丁香各部位可溶性非淀粉多糖含量遠(yuǎn)低于小麥、玉米等谷物[10]。草酸含量也遠(yuǎn)低于菠菜[鮮樣（1 815±33.2）mg/100 g][18]的含量，一旦人體攝入的草酸過(guò)量，草酸會(huì)與體內(nèi)的Ca2+和Zn2+結(jié)合形成難溶的草酸鈣和草酸鋅沉淀，將導(dǎo)致人體缺乏鈣元素和鋅元素并引發(fā)結(jié)石等疾病[19-20]。丁香果實(shí)粗凝集素含量為1.93 mg/g，與大豆中凝集素含量相當(dāng)[21]，但葉的粗凝集素含量為0.97 mg/g為4個(gè)部位最低，可能丁香的粗凝集素含量與凝血能力并不具備線性關(guān)系。丁香各部位胰蛋白酶抑制活性最高的部位為果實(shí)，低于大豆的胰蛋白酶抑制活性[22]。綜上所述，且丁香花蕾本身就是既是食品又是藥品，丁香各部位抗?fàn)I養(yǎng)因子含量通過(guò)與花蕾部位和其他常見食品之間的比較，其均在合理健康安全的范圍內(nèi)，這表明丁香各部位在抗?fàn)I養(yǎng)因子方面均適合作為食品或飼料的開發(fā)。