熱帶睡蓮精油的超臨界CO2萃取優化及其成分GC-MS分析

黃秋偉，毛立彥，龍凌云，唐毓瑋

（廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西南寧530001）

植物精油，又稱植物芳香油，指的是一類相對分子量較小的植物次生代謝產物，通常蘊含于植物體的香氣部位，本身具有濃郁、鮮明的香氣特征和揮發性。國際標準化組織定義植物精油是存在于植物體的一類可隨水蒸氣蒸餾得到，且具有一定香味的揮發物油狀液體。精油按其來源可分為八大類，其中花香類精油算是來源比較廣泛的一類[1]。目前植物精油的主要提取手段有水蒸氣蒸餾、吸附法、溶劑浸提、超臨界流體萃取、亞臨界流體萃取等這幾種，常用的水蒸氣蒸餾和溶劑浸提在提取時往往會引起部分精油組分的改變，造成芳香味流失或者改變，同時會有溶劑殘留的風險。而超臨界流體萃取采用的流體（如CO2）通常是無害的，且在超臨界狀態下流體對揮發性溶質的溶解度增加顯著，流體與溶質分離方便，無溶劑殘留。因此采用超臨界流體萃取植物精油是一種比較環保且提取效率較高技術手段，當前關于應用超臨界流體技術萃取植物油脂方面的研究報道日趨增多[2-6]。植物精油主要是一些揮發性成分，而關于揮發性成分的分析技術應用較為成熟的是氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），且相關報道較多[7-14]。

睡蓮是世界名花之一，為睡蓮科睡蓮屬多年生宿根草本類植物，廣泛分布于熱帶和溫帶地區。該屬植物按其生態學特征可分為熱帶睡蓮和耐寒睡蓮兩大類，其中，大多數熱帶睡蓮的品種及栽培種的鮮花色彩鮮艷、芳香氣味獨特且清雅宜人，而其它植物部位不具備芳香氣味。芳香氣味一般均來自植物精油中的揮發性有機物，目前，關于睡蓮的研究主要集中于基因組及形態多樣性分析[15-16]、睡蓮花色組成[17]、睡蓮生理機制[18-19]、品種栽培與選育[20]、睡蓮對水環境的金屬離子吸收機制[21]等方向，但在睡蓮精油的提取研究報道極少，而關于應用超臨界流體技術萃取熱帶睡蓮精油的研究暫未見報道，因此開展熱帶睡蓮精油超臨界萃取工藝研究具有一定的意義。本文選用熱帶睡蓮的代表品種“保羅蘭”作為研究對象，采用超臨界CO2萃取法來提取熱帶睡蓮精油，同時通過單因素及正交試驗來優化提取工藝，并利用GC-MS檢測手段檢測分析超臨界CO2萃取得到的睡蓮精油揮發性組分，為熱帶睡蓮精油今后在食品、醫藥及化妝領域的綜合開發利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱帶睡蓮鮮花：廣西亞熱帶作物研究所提供的“保羅蘭”品種；CO2氣體（食品級，純度≥99.9%）：廣西國信氣體研究院有限公司；無水乙醇（2.5 L裝分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

HA221-40型超臨界流體萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；7980A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國 Agilent公司；50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭：美國SUPELCO公司；MJ33型快速水分測定儀：梅特勒-托利多公司；GR200型電子分析天平：日本A&D公司。

1.3 方法

1.3.1 超臨界CO2萃取材料的篩選

1.3.1.1 鮮花采摘時間的篩選

睡蓮花一般連續開花4 d～5 d就會出現凋謝跡象，同時伴隨開花時間的延長，鮮花體內的次生代謝物含量也會發生變化，因此，鮮花材料的采摘時間選擇對精油得率的高低有一定的影響。本次試驗選用開花前3 d的鮮花作為考察對象，并通過水蒸氣蒸餾進行預試驗篩選出適合的鮮花采摘時間。依據《中華人民共和國藥典》2010版Ⅰ部附錄XD揮發油測定法的甲法操作步驟進行水蒸氣蒸餾提取精油試驗。按睡蓮花開花1 d、開花2 d、開花3 d的開花時間順序分成3組，并將其鮮花作為提取原料來采摘，每組鮮花原料各稱取50 g，固定料液比 1∶10（g/mL）及回流提取時間 5 h兩個提取條件進行水蒸氣蒸餾。提取結束后，利用微量注射器吸取收集器內的油相成分，轉移至離心管中并進行稱重，之后置于-20℃條件下冷凍保藏備用，按下式計算精油得率，比較不同開花時間對精油得率的影響，以此來篩選出鮮樣的精油出油量最高的睡蓮鮮花材料采摘時間。

式中：m表示收集器的油相質量，g；M表示提取的鮮樣質量，g。

1.3.1.2 不同花器官材料的篩選

為保持鮮花精油活性，本次超臨界萃取試驗樣品不進行物理干燥及粉碎預處理，采用鮮樣形式進行萃取，而鮮樣含水量太高的話，則會影響精油的超臨界萃取效率。本次試驗選用鮮花整花以及不同的花部位作為研究對象，并通過水蒸氣蒸餾進行預試驗篩選出精油富集的花部位，以此為材料來減輕水分對萃取效率的影響。依據1.3.1.1步驟所得的試驗結果，將其篩選出來的鮮花材料作為試驗材料。固定料液比1∶10（g/mL）及回流提取時間5 h兩個提取條件，以鮮花整花提取作為對比，分別選取睡蓮鮮花的子房、雄蕊、花瓣這三部分作為提取材料，整花材料稱重50 g，而后面三者的稱重方式則是以所稱取的整花重量為基準，按三者在整花中的重量占比來進行換算稱重。在整花重量中，三者重量占比依次為：子房重量55%＞雄蕊重量35%＞花瓣重量10%。各個部分稱重完畢后按操作進行水蒸氣蒸餾提取。提取結束后，利用微量注射器吸取收集器內的油相成分，轉移至離心管中并進行稱重，之后置于-20℃條件下冷凍保藏備用，計算精油得率，比較整花與不同花器官對精油得率的影響，以此來篩選出油量最高的鮮花部位。

1.3.2 超臨界CO2萃取精油的單因素和正交試驗

超臨界CO2萃取過程中的影響因素較多，本次優化試驗先選用超臨界CO2萃取提取過程中萃取壓力、溫度及時間3個主要影響因素進行研究，考察精油得率隨這3個主因的改變而表現出來的變化規律。主要操作流程如下：稱取1.3.1步驟篩選出來的鮮花材料50 g，取1 L裝料罐進行裝料，并放入萃取釜中密封關閉?？刂艭O2流速30 L/h左右，在分離釜Ⅰ壓力6.0 MPa、分離釜Ⅰ溫度30℃、分離釜Ⅱ壓力5.8 MPa、分離釜Ⅱ溫度25℃這一分離條件下，設置萃取壓力及萃取溫度，當萃取釜的壓力及溫度達到相應的設置條件時，開始計時并維持該萃取條件進行動態循環萃取，當萃取時間達到設定的時間后，停止萃取，從分離釜下方的出料口中接取分離得到的物料，利用微量注射器從分離得到的物料中吸取漂浮于水相上面的黃色油層，轉移至離心管中，進行稱重，之后置于-20℃條件下冷凍保藏備用，并按照下式計算精油得率。

式中：m1表示分離釜Ⅰ出口油相質量，g；m2表示分離釜Ⅰ出口油相質量，g；m表示萃取鮮樣質量，g。

1.3.2.1 萃取壓力對得率的影響

稱取50 g的睡蓮鮮樣5份，分別將萃取壓力設置成 20、22.5、25、27.5、30 MPa這 5 個水平，在固定萃取溫度40℃、動態循環萃取時間90 min的條件下進行精油萃取，萃取結束后從分離釜中接取物料，利用微量注射器吸取黃色油層，轉移至離心管中，進行稱重并計算得率，比較不同萃取壓力對睡蓮精油提取率的影響。

1.3.2.2 萃取溫度對得率的影響

稱取50 g的睡蓮鮮樣5份，分別將萃取溫度設置成 30、35、40、45、50 ℃這 5 個水平，在固定萃取壓力20 MPa、動態循環萃取時間90 min的條件下進行精油萃取，萃取結束后從分離釜中接取物料，利用微量注射器吸取黃色油層，轉移至離心管中，進行稱重并計算得率，比較不同萃取溫度對睡蓮精油提取率的影響。

1.3.2.3 萃取時間對得率的影響

稱取50 g的睡蓮鮮樣5份，分別將萃取時間設置30、60、90、120、150 min 這 5 個水平，在固定萃取壓力20 MPa、萃取溫度40℃的條件下進行精油萃取，萃取結束后從分離釜中接取物料，利用微量注射器吸取黃色油層，轉移至離心管中，進行稱重并計算得率，比較不同萃取壓力對睡蓮精油提取率的影響。

1.3.2.4 超臨界CO2萃取精油的正交試驗

根據單因素試驗結果，將萃取壓力、萃取溫度、萃取時間選為試驗因素，每個因素個設置水平3個，采用四因素三水平的正交表進行正交試驗設計，具體因素及水平設置見表1。本次正交試驗以睡蓮花精油得率作為提取優劣的評價指標，并以此來對超臨界CO2萃取睡蓮花精油的工藝條件進行優化。

表1 正交試驗設計表Table 1 Orthogonal array design table

1.3.3 揮發性成分分析

1.3.3.1 上樣前的樣品處理及進樣

取0.5 g超臨界萃取油相樣品置于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋。于60℃的溫度條件下平衡5 min，然后用固相微萃取針于60℃下萃取25 min，最后于進樣口解吸5 min。

1.3.3.2 儀器分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱子（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為 He，流速 1 mL/min，分離比5∶1；進樣溫度為250℃；升溫程序為起始溫度為40℃，保持5 min，以8℃/min，升至250℃，保持5 min。質譜條件：EI電離子源，能量70 eV；離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，掃描范圍30～400 m/z。

1.4 數據分析

本次研究中的單因素及正交試驗數據均采用SPSS19.0統計軟件進行顯著性分析和方差分析。成分數據定性分析是通過NIST08譜圖庫檢索法結合人工譜圖分析法來分析；定量分析則是按照峰面積歸一化法來進行計算，從而分析相對含量。

2 結果與分析

2.1 超臨界萃取材料的篩選結果

2.1.1 開花時間對精油出油率的影響

不同開花時間的鮮花采摘對精油出油率的影響結果見圖1。

圖1 開花時間對精油得率的影響Fig.1 Effect of flowering times on the yield of essential oil

如圖1所示，隨著開花時間的延長，睡蓮精油得率呈現出下降的趨勢，且均表現出了顯著性差異。在同樣的提取條件下，開花2 d的精油得率只有0.152%，相較于開花1 d的精油得率0.176%下降了13%，下降幅度較大。開花3 d的精油得率下降則更為明顯，只有0.109%，相較于開花2 d的得率下降了28%。因此，為了獲得較高的精油得率，本次超臨界萃取試驗決定摘取開花1 d的睡蓮鮮花作為后續的篩選材料。

2.1.2 花器官取材對精油出油率的影響

不同鮮花部位對精油出油率的影響結果見圖2。

圖2 不同花部位對精油得率的影響Fig.2 Effect of different part from flower on the yield of essential oil

如圖2所示，同樣的提取條件，不同花部位的精油得率均各不相同，其中，子房和花瓣兩者的精油得率分別為0.026%、0.032%，花瓣得率略高于子房，但兩者不顯著。雄蕊的精油得率約為0.178%，與子房和花瓣兩者的得率相比要高得多，且差異顯著，而相對于整花的提取效果，整花的精油得率約為0.171%，雄蕊精油的得率稍微高一些，但無顯著性差異。出現上述變化現象，是由于在大多數熱帶睡蓮品種中，鮮花中雄蕊揮發性物質含量幾乎在70%～90%之間，與整體鮮花的揮發物含量無顯著差異。而花瓣與子房的揮發性物質含量較低，且子房的揮發物不具備芳香。由此可以認為睡蓮雄蕊的揮發性物質含量能夠代表整朵鮮花的含量。而鮮花含水量經測定一般都在92%左右，含水量太高，不利于超臨界萃取。因此，綜合含水量和精油含量這兩方面來考慮，本次超臨界萃取試驗決定采用雄蕊作為鮮樣材料。

2.2 超臨界CO2萃取精油的單因素試驗結果

2.2.1 萃取壓力對精油得率的影響

在固定萃取溫度40℃、動態循環萃取時間90 min的條件下，設置不同萃取壓力水平對鮮樣精油得率的影響結果見圖3。

圖3 萃取壓力對精油得率的影響Fig.3 Effect of extraction pressure on the yield of essential oil

由圖3可知，睡蓮精油得率隨著壓力的升高呈現出不規則的變化，當壓力從20 MPa往22.5 MPa升高時，精油得率顯著下降，下降幅度約為46%。當壓力從22.5 MPa往27.5 MPa區間升壓時，精油得率表現出升高的態勢，且差異顯著，27.5 MPa時得率達到最高，約為1.42%。當壓力升高至30 MPa，精油得率又顯著降低，下降至1.19%。壓力從20 MPa往22.5 MPa升高，精油得率下降的原因可能是由于含水量較多的鮮樣，在升高壓力時，細胞質內的水分受壓力擠壓加速滲出，從而在物料的表面形成一層水膜，既不利于溶質的溶出，也不利于CO2的進入，增加了傳質阻力，而此時的壓力條件又不足以破除這種水膜阻斷作用，使得萃取率顯著下降[22]。當壓力為30 MPa時，此時高壓條件下的CO2流體密度增加降低，精油分子溶出減弱而導致得率下降。因此，本次正交試驗選取25、27.5、30 MPa作為試驗水平。

2.2.2 萃取溫度對精油得率的影響

在固定萃取壓力20MPa、動態循環萃取時間90min的條件下，設置不同萃取溫度水平對鮮樣精油得率的影響結果見圖4。

如圖4所示，睡蓮精油得率隨著萃取溫度的提高表現出規律性變化，當萃取溫度在30℃～45℃這一段升溫區間時，隨著溫度的提高，各個溫度梯度的精油得率表現出了顯著升高的規律性變化，而當溫度達到45℃時，精油得率達到最高，約為1.35%。當溫度進一步提高至50℃時，精油得率出現顯著下降，降至0.88%。這是由于溫度升高，熱效應增強，精油分子加速隨流體溶出，當溫度過高時，精油中的一些熱敏成分出現損失而導致得率降低。因此，本次正交試驗選取40、45、50℃這3個梯度作為試驗水平。

圖4 萃取溫度對精油得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of essential oil

2.2.3 萃取時間對精油得率的影響

在固定萃取壓力20 MPa、萃取溫度40℃的條件下，設置不同動態循環萃取時間水平對鮮樣精油得率的影響結果見圖5。

圖5 萃取時間對精油得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of essential oil

如圖5所示，睡蓮精油得率隨著萃取時間的延長表現出規律性變化。當萃取時間從30 min～90 min這一區間逐步延長時，各個時間梯度的精油得率呈現出了逐漸升高的態勢，且均有顯著性差異。當時間從90 min延長至120 min時，精油得率出現升高，但差異性不顯著，此時精油得率最高，約為1.10%。當時間進一步延長至150 min時，精油得率出現下降，但與90、120 min兩個梯度相比，但無顯著差異。這是由于隨著時間延長，精油分子與CO2流體接觸越充分，溶出越多，從而得率不斷提高，當時間延長至90 min時，溶出效果慢慢達到飽和，時間再往后延長，萃取效率處于一種略微浮動的平衡狀態。因此，本次正交試驗選取90、120、150 min這3個梯度作為試驗水平。

2.3 超臨界CO2萃取精油的正交試驗結果

以睡蓮花精油得率作為提取優劣的評價指標，超臨界CO2萃取睡蓮花精油的正交試驗結果如表2所示。試驗結果的方差分析見表3。

表2 正交試驗及結果Table 2 Orthogonal test and result

表3 方差分析結果Table 3 Analysis result of variance about orthogonal test

由表2的極差R值計算結果可以看出，所選取的試驗因素對于睡蓮精油得率的影響順序依次為：萃取壓力＞萃取溫度＞超聲時間，將空列D排除，選擇萃取壓力、萃取溫度、萃取時間3個因素的正交試驗數據做后續的方差分析。從方差分析結果中可以看出，正交試驗中的萃取壓力及萃取溫度對睡蓮精油得率的影響有顯著性差異（P＜0.05），萃取時間對精油得率的影響無顯著差異，這與單因素試驗中所選取的各個因素試驗水平所表現出來的差異性結果相一致。此外，從正交試驗的數據計算結果，可以很明顯的看出，理論上的最佳睡蓮精油萃取工藝條件為A2B2C2。依據這一理論條件來做驗證性試驗，并平行重復3次，睡蓮精油得率分別為1.96%、1.87%、1.92%，重復的均值為1.91%，平行試驗的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值為2.35%，因此，可以認為通過正交優化試驗得到的理論工藝條件具備重復操作性。由此可以得出，超臨界CO2萃取睡蓮精油的最佳工藝參數為：萃取壓力27.5 MPa、萃取溫度45℃、萃取時間120 min。

2.4 揮發性成分GC-MS分析結果

超臨界萃取睡蓮油樣品經頂空固相微萃取，并利用GC-MS檢測技術對其內含組分進行分析，其揮發性成分及相對含量如圖6和表4所示。

圖6 熱帶睡蓮精油的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of essential oil in tropical water lily

如圖6所示，超臨界萃取的精油樣品經頂空固相微萃取后，通過GC-MS技術檢測，在31 min內得到了該精油的總離子流圖，在圖中總共出現了54個離子峰，表明共檢測出了54種化合物，并通過分析在表4中分別列出了這54種化合物的名稱及其相對含量。其中，在這54種化合物中出現了乙醇和11種苯類物質，但相對含量均偏低。出現這情況可能是由外界引入的一些干擾物質導致檢出的，因在每次超臨界萃取操作前都會用無水乙醇對儀器進行清洗后，再開始新物質的提取，因此可能是由于附著于儀器管路的殘留無水乙醇與精油混合而導致乙醇分子的檢出。本次試驗貯存睡蓮精油所用的離心管是由苯類化合物聚合而成的樹脂聚合物，而精油對各種蠟、樹脂類、脂肪以及樹膠類等物質具備一定的溶解能力，因此可能是在保存的過程中離心管中的苯類物質微量溶于精油中，才導致苯類化合物的檢出。

表4 睡蓮精油各組分的檢測結果Table 4 Analysis result of essential oil in tropical water lily

續表4 睡蓮精油各組分的檢測結果Continue table 4 Analysis result of essential oil in tropical water lily

排除上述的12種干擾物質后，本次研究中的超臨界萃取的睡蓮精油樣品可檢測出的揮發類化合物有42種。從表4中可以看出，烷烴類和烯烴類化合物在種類及含量均占有優勢，其次依次是醇類、醛類和酮類化合物，由此可以看出烴類、醇類、醛類和酮類化合物是睡蓮精油芳香成分的主效物質。其中烷烴類化合物有12種，相對含量為46.371%；烯烴類化合物有11種，相對含量為49.513%；醇類化合物有5種，相對含量為14.864%；醛類化合物有5種，相對含量為2.508%；酮類化合物有4種，相對含量為2.027%。此外，在這些化合物中，相對含量超過5%的有5種，含量最多的成分是6，9-十七碳二烯（含量為25.406%），其次依次是十五烷（含量為22.010%）、芐基醇（含量為11.011%）、8-十七碳烯（含量為9.916%）和金合歡烯（含量為8.601%）。上述優勢成分及相對含量的排序分析結果與袁茹玉[23]利用固相微萃取技術，萃取22個熱帶睡蓮栽培品種鮮花整花的揮發性物質GC-MS分析結果相一致。

3 結論

本次研究首次采取超臨界CO2萃取熱帶睡蓮精油，并對其萃取工藝參數進行優化試驗。先以不同開花時間的鮮花和不同鮮花部位作為研究對象進行預試驗，并以水蒸氣蒸餾法來提取精油，比較精油得率來進行超臨界萃取原材料的篩選。預實驗結果表明，睡蓮鮮花開花時間越長，精油得率越低，開花一天的精油得率最高；在不同的花部位中，睡蓮雄蕊的精油得率最高，且與鮮花整花相比無顯著差異，因此將開花一天的睡蓮鮮花雄蕊作為超臨界萃取工藝優化試驗的材料。經單因素和正交試驗優化工藝，試驗表明，超臨界CO2萃取睡蓮精油的最佳工藝參數為萃取壓力27.5 MPa、萃取溫度45℃、萃取時間120 min，在此條件下的睡蓮精油得率約為1.91%，與篩選試驗中的熱帶睡蓮雄蕊水蒸氣蒸餾精油得率0.176%相比，得率顯著提高。萃取所得的精油經GC-MS檢測分析，排除一些外界引入的干擾物后，共分離出42種揮發性成分，其中優勢成分分別是6，9-十七碳二烯（含量為25.406%）、十五烷（含量為22.010%）、芐基醇（含量為11.011%）、8-十七碳烯（含量為9.916%）和金合歡烯（含量為8.601%）這5種。本次試驗結果可為熱帶睡蓮精油今后食品、醫藥及化妝領域進一步的開發利用提供科學理論依據。