花青素穩(wěn)定性影響因素及改善方法研究進(jìn)展

徐青，王代波，劉國(guó)華，李冰晶，周元敬

（1.貴州科學(xué)院生物研究所，貴州貴陽(yáng)550009；2.貴州科學(xué)院分析測(cè)試研究院，貴州貴陽(yáng)550000）

花青素（Anthocyanidin），又稱(chēng)花色素，是自然界廣 泛存在的一種水溶性天然色素，最早是從紅葡萄渣中提取出來(lái)的葡萄皮紅，并于1879年在意大利上市。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在越橘、紫甘薯、黑醋栗、葡萄皮、紫茄果皮等中均含有豐富的花青素，其廣泛分布于27個(gè)科，72個(gè)屬的被子植物體的花、果實(shí)、種子和葉片中。花青素屬于酚類(lèi)化合物中的類(lèi)黃酮類(lèi)（flavonoids）化合物，具有抗氧化、抗癌癥、抗炎癥、抗衰老、抗肥胖、改善大腦功能、保護(hù)視力、保護(hù)心血管、保健皮膚和美容等方面的功效，在食品飲料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。然而，天然的花青素是不穩(wěn)定的，受本身結(jié)構(gòu)和外界環(huán)境的影響而變質(zhì)，對(duì)光照、溫度、pH值、金屬離子、氧化劑等因素敏感，使其的應(yīng)用范圍受到很大限制[5-6]。研究并提高花青素在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性，從而拓寬其應(yīng)用范圍具有非常重要的意義。本文綜述了花青素的穩(wěn)定性研究概況，并分別從物理和化學(xué)兩個(gè)角度重點(diǎn)探討了提高花青素穩(wěn)定性的處理方法和技術(shù)手段，以期為花青素的深入研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 結(jié)構(gòu)和種類(lèi)

花青素的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

由圖1可知，基本母核單元是2-苯基苯并吡喃，即花色基元（Flavylium）。絕大多數(shù)花青素在花色基元的3-，5-，7-位碳上有取代羥基，由于B環(huán)各碳位上所帶羥基數(shù)（-OH）、甲基化（methylation）、糖基化（glycosylation）數(shù)目、糖種類(lèi)和連接位置的不同而呈現(xiàn)不同顏色。自然界已知的花青素有22大類(lèi)，500多種，其中最為常見(jiàn)的6種花青素分別為：矢車(chē)菊素或芙蓉花色素（Cyanidin）、飛燕草素或花翠素、翠雀素（Delphinidin）、天竺葵素（Pelargonidin）、芍藥素（Peonidin）、牽牛素（Petunidin）和錦葵素（Malvidin），其具體結(jié)構(gòu)和顏色如表1所示。

表1 6種常見(jiàn)的花青素Table 1 Six common anthocyanidins

這6種花青素占了總量的90%以上，它們?cè)谧匀唤缰械姆植急壤謩e約為50%、12%、12%、12%、7%、7%。其中矢車(chē)菊素、飛燕草素和天竺葵素分布最為廣泛和普遍，80%的有色葉子、69%的果實(shí)和50%的花朵中都有存在[7]。

花青素一般以糖苷形式存在，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過(guò)糖苷鍵形成花色苷（Anthocyanin）。糖苷可取代 3，5，7 位，其中 3-糖苷最為常見(jiàn)。

2 花青素穩(wěn)定性影響因素

花青素被公認(rèn)為最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一，是因?yàn)槠渚哂腥彪娮拥慕Y(jié)構(gòu)特征，極易受到活性氧負(fù)離子和自由電子的攻擊。正因如此，使花青素具有較大的不穩(wěn)定性且易發(fā)生降解作用。除了自身結(jié)構(gòu)外，外界pH值、溫度、光、金屬離子、輔色素、食品添加劑等環(huán)境因素也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性[8-9]。

2.1 結(jié)構(gòu)的影響

從化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看，花青素的母核單元缺少一個(gè)電子，其穩(wěn)定性主要受結(jié)構(gòu)中B環(huán)取代基的影響，羥基或甲基等供電子基團(tuán)的存在會(huì)降低其穩(wěn)定性，特別是在中性條件下最不穩(wěn)定，反之則穩(wěn)定性較好，因此天竺葵色素是最穩(wěn)定的花青素[10]。研究發(fā)現(xiàn)，95℃熱處理黑加侖提取液150 min，其中主要的4種花色苷熱穩(wěn)定順序?yàn)椋菏杠?chē)菊素-3-蕓香糖苷＞花翠素-3-蕓香糖苷≈矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷＞花翠素-3-葡萄糖苷[11]。就糖基化而言，花色苷的穩(wěn)定性受糖基的類(lèi)型、數(shù)量及結(jié)合位點(diǎn)的影響?；ㄇ嗨靥擒栈牧u基化會(huì)使花青素的穩(wěn)定性降低，而糖苷基的甲基化、糖基化、?；紩?huì)增加花青素的穩(wěn)定性；不同的糖基也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性，按照葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的順序依次降低[12]。

2.2 pH值的影響

在研究中發(fā)現(xiàn)，花青素作為一種水溶性色素，其顏色可隨細(xì)胞液的酸堿度而改變，細(xì)胞液呈酸性則偏紅，細(xì)胞液呈堿性則偏藍(lán)。該現(xiàn)象說(shuō)明花青素的穩(wěn)定性受pH值影響較為明顯，這是因?yàn)榛ㄇ嗨氐娜彪娮有螒B(tài)在環(huán)境pH值發(fā)生變化時(shí)受電荷的影響，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也相應(yīng)發(fā)生變化。不同pH值下花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)和降解反應(yīng)見(jiàn)圖2。

如圖2所示，花青素隨pH值變化在黃鹽陽(yáng)離子、醌型堿、假堿、查耳酮4種形式之間發(fā)生可逆改變。當(dāng)溶液的pH 1時(shí)，花青素主要以黃鹽陽(yáng)離子形式存在，溶液顯紫色或紅色；當(dāng)pH值在2～4之間時(shí)，花青素失去C環(huán)氧上的陽(yáng)離子變成藍(lán)色醌型堿。醌型堿在酸性溶液中與黃洋鹽陽(yáng)離子間發(fā)生可逆轉(zhuǎn)化；當(dāng)pH值升高為5～6時(shí)，主要以假堿和查耳酮兩種形式存在且二者也可發(fā)生可逆轉(zhuǎn)化，溶液呈無(wú)色。即當(dāng)pH值在4～6之間時(shí)花青素的4種不同結(jié)構(gòu)形式共存，它們通過(guò)黃鹽陽(yáng)離子在醌基和甲醇基之間建立平衡，當(dāng)pH值高于7時(shí)，花青素將被降解。因此，在強(qiáng)酸性條件下，花青素將以黃鹽陽(yáng)離子這一相對(duì)穩(wěn)定的單一離子形式存在[13-14]。

圖2 不同pH值下花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)和降解反應(yīng)Fig.2 Chemical structure and degradation reaction of anthocyanidins at different pH

2.3 溫度的影響

研究表明，無(wú)論在天然狀態(tài)下還是實(shí)驗(yàn)室條件下，花青素的穩(wěn)定性都會(huì)受到溫度的影響。一方面，高溫會(huì)促使花青素糖苷的水解，從而失去保護(hù)而降解；另一方面，高溫會(huì)使花青素芘環(huán)水解產(chǎn)生白堊，這也是花青素受熱變成棕色的原因[15]。野生狀態(tài)下，25℃是藍(lán)莓花青素最為穩(wěn)定的一個(gè)溫度，當(dāng)溫度逐漸升高到60℃時(shí)，花青素就會(huì)以查爾酮式結(jié)構(gòu)存在，穩(wěn)定性變得非常差，顏色也轉(zhuǎn)為無(wú)色[16]。當(dāng)花色苷溶液加熱時(shí)，平衡向著無(wú)色查耳酮方向進(jìn)行，同時(shí)引起有色型化合物的降低。當(dāng)冷卻和酸化時(shí)醌型堿和假堿迅速變成陽(yáng)離子，但是查耳酮的變化相當(dāng)慢，在25℃下3，5-二葡萄糖苷和3-葡萄糖苷的查耳酮型達(dá)到與其相應(yīng)的黃洋鹽陽(yáng)離子的平衡分別需用12 h和6 h～7 h，而且溫度越低需時(shí)越長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，花青素的受熱降解為一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[17]。

2.4 光的影響

光對(duì)花青素的影響有兩個(gè)方面，一方面光照能夠促進(jìn)花青素的生物合成，另一方面光照能加速花青素本身發(fā)生降解[17-21]。謝程程的研究表明長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)誘導(dǎo)花青素碳骨架在C2位上斷開(kāi)，形成C4羥基的降解中間產(chǎn)物，之后被氧化成查耳酮，而查耳酮進(jìn)一步被氧化為苯甲酸及2，4，6-三羥基苯甲醛等終水解產(chǎn)物，從而導(dǎo)致花色苷被降解，顏色消退[17]。Ochoa等研究表明光使花青素的降解也符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，在有光和避光條件下花青素的降解有顯著差異[20]。

2.5 金屬離子的影響

有研究表明，大多數(shù)金屬離子是保護(hù)花青素穩(wěn)定性的，展現(xiàn)出護(hù)色效果，不同顏色是因?yàn)榻饘匐x子與花青素黃洋鹽離子形成的螯合物的作用產(chǎn)生的。金屬離子的濃度以及護(hù)色對(duì)象不一樣，其護(hù)色的效果也不一樣。例如Ca2+、Cu2+、A13+等具有增色作用但其對(duì)花色苷的穩(wěn)定性并沒(méi)有顯著的影響，而高濃度的Zn2+、Mg2+不僅具有增色作用，而且能夠增加藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性。但并不是所有金屬離子都會(huì)提高花青素的穩(wěn)定性，如 Fe2+、Fe3+、Pb2+等對(duì)花青素具有破壞作用，使花青素的穩(wěn)定性下降；Fe3+、Sn2+可使紫甘薯花青素溶液顏色加深并生成沉淀[22-23]。

2.6 食品添加劑的影響

食品添加劑也會(huì)對(duì)花青素的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，且不同的食品添加劑影響程度也不一樣。徐馨等研究了不同添加劑對(duì)火龍果皮紅色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明：茶多酚、沒(méi)食子酸會(huì)破壞紅色素的顏色，而檸檬酸、山梨醇、苯甲酸鈉、抗壞血酸可一定程度上提高紅色素的穩(wěn)定性[24]。姚思敏薔等研究發(fā)現(xiàn)木糖醇和丁基羥基茴香醚會(huì)使黑果枸杞中花青素溶液褪色，0.1%抗壞血酸會(huì)增加花青素顏色的穩(wěn)定性，高濃度抗壞血酸起到反作用，沒(méi)食子酸丙酯對(duì)花青素穩(wěn)定性起保護(hù)作用，山梨酸鉀和雙氧水會(huì)破壞花青素類(lèi)物質(zhì)[25]。

3 提高花青素穩(wěn)定性的方法

花青素的穩(wěn)定性較差，其降解變質(zhì)不僅發(fā)生在提取純化的制備過(guò)程中，而且存在于存儲(chǔ)、加工過(guò)程中。目前關(guān)于提高花青素穩(wěn)定性的方法研究報(bào)道較多，本文分別從物理和化學(xué)兩種方法進(jìn)行闡述。

3.1 物理方法

3.1.1 常規(guī)手段

由于花青素的穩(wěn)定性受pH值、溫度、光等的影響顯著，因此，在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中，應(yīng)盡量保證pH值小于3、低溫（＜60℃）、避光保存[26]。研究表明，為了保證藍(lán)莓飲料中花色苷的穩(wěn)定性，應(yīng)以高溫短時(shí)滅菌（121℃，10 s）和存儲(chǔ)完整的標(biāo)簽包裝[27]。藍(lán)莓鮮果最好-18℃凍存；藍(lán)莓果汁最好4℃貯藏，且酸度盡量調(diào)低，如調(diào)到pH 2.1，這樣不僅可以保留更多的花青素，而且可以起到更好的抗氧化功效[11，28]。

3.1.2 添加輔色劑

輔色劑分子中通常含有豐富電子，這些電子與2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子相互作用，避免水的親核攻擊，稱(chēng)為輔色效應(yīng)，對(duì)花青素具有顯著的穩(wěn)定作用。輔色劑種類(lèi)包括黃酮、生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸、多糖、金屬離子以及花青素本身[29]。研究發(fā)現(xiàn)，L-色氨酸通過(guò)氫鍵和疏水相互作用可使含抗壞血酸體系中花青素的半衰期延長(zhǎng)3.91 d[30]。在酚類(lèi)和花青素共色作用中，電離電位是影響共色效果的決定性因素，電離電位越負(fù)，給電子能力越強(qiáng)，穩(wěn)定效果越好[31]，Cruz等還認(rèn)為酚類(lèi)提升穩(wěn)定性的效果與其分子立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，共平面的酚類(lèi)如槲皮素、蘆丁等的共色效果優(yōu)于不共平面的酚類(lèi)如兒茶素、表兒茶素等[32]。花青素本身屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，可通過(guò)芳香母核之間的疏水相互作用，形成垂直堆疊的分子復(fù)合物，使其穩(wěn)定性增強(qiáng)，然而這種自締合作用受濃度、溶液pH值、溫度及溶劑等因素的影響比較明顯[33-34]。

3.1.3 與有機(jī)大分子復(fù)合

花青素可通過(guò)氫鍵、靜電效應(yīng)和疏水效應(yīng)等相互作用分別與蛋白質(zhì)、環(huán)糊精、多糖等有機(jī)大分子形成復(fù)合物，從而提高其熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。研究表明，矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷和牛血清白蛋白之間的復(fù)合，氫鍵是主要結(jié)合力[35]，復(fù)合后的矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷對(duì)光、熱以及強(qiáng)氧化還原劑的穩(wěn)定性顯著提高，且具有更好的自由基清除能力和對(duì)鐵的還原能力[36]。Wu研究發(fā)現(xiàn)甘露糖蛋白能與花青素通過(guò)疏水相互作用形成復(fù)合物，將花青素的熱穩(wěn)定性（pH 7.0，80℃或126℃熱處理30 min）提高4倍～5倍[37]。

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）利用“外壁親水、內(nèi)腔疏水”的圓臺(tái)形結(jié)構(gòu)與花青素分子形成環(huán)糊精-花青素包結(jié)物，但其提高花青素穩(wěn)定性的效果與環(huán)糊精和花青素的種類(lèi)、溶液pH值等都有關(guān)[38]。Howard等的研究認(rèn)為pH 3.6及3%的β-CD添加量對(duì)野櫻莓花青素貯藏穩(wěn)定性的提升效果最好[39]。Fernandes等的研究表明β-CD對(duì)矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷溶液顏色具有減褪作用，且這種作用隨pH值增加變得越明顯；而α-CD對(duì)它的溶液顏色卻無(wú)顯著影響[40-42]。

多糖與花青素的復(fù)合，根據(jù)分子種類(lèi)、溶液pH值等因素的不同，對(duì)花青素穩(wěn)定性可產(chǎn)生促進(jìn)、降低和無(wú)影響3種情況[43]。如花青素通過(guò)與阿拉伯膠上的糖蛋白發(fā)生氫鍵作用形成復(fù)合物，從而可抑制飲料中抗壞血酸對(duì)紫胡蘿卜花青素的降解[44]。Guan等通過(guò)疏水相互作用形成納米尺度的復(fù)合物，可使pH 5.0的花青素溶液在80℃和126℃的熱穩(wěn)定性分別提高2倍和1.8倍[45]。陰離子型多糖卡拉膠能與花青素通過(guò)靜電相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物[46]。

3.1.4 膠囊包埋

近年來(lái)，膠囊包埋在對(duì)食品活性成分的穩(wěn)定化及生物利用度提升方面表現(xiàn)出巨大的潛力[47-48]。目前用于制備花青素膠囊的方法，主要包括離子交聯(lián)法、乳化-熱膠凝法、噴霧干燥以及冷凍干燥法等，包埋的體系主要有3類(lèi)：微膠囊、脂質(zhì)體（Liposomes）和聚合物納米顆粒（Polymer nanoparticles）[49]。Ko等用芥子酸對(duì)黑大豆花青素進(jìn)行輔色，采用離子凝膠法制備納米膠囊后，花青素的顏色更穩(wěn)定，抗氧化活性更有效[50]。He等用殼聚糖納米顆粒包埋藍(lán)莓花青素，納米顆粒平均粒徑219 nm，包埋的花青素在模擬胃腸液中降解緩慢，在模擬飲料中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性也明顯提升[51]。

3.1.5 其他手段

韓成云研究發(fā)現(xiàn)，不同提取方法對(duì)紫薯花青素的穩(wěn)定性影響不同，微波法提取的紫薯花青素?zé)岱€(wěn)定性效果最佳，超聲波法提取的紫薯花青素對(duì)pH值穩(wěn)定性最佳[52]。Rabelo等將Acai漿果提取物制備成一種水包油的納米乳液，可以顯著提高花青素的保存率[53]。植物組織培養(yǎng)不僅可以提高花青素產(chǎn)量，還是增強(qiáng)花青素穩(wěn)定性的有效途徑。

3.2 化學(xué)方法

花青素通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行修飾，往往具有更高的穩(wěn)定性。這是因?yàn)榛ㄉ罩械奶擒栈膳c一個(gè)或多個(gè)分子的有機(jī)酸，主要有咖啡酸、阿魏酸、安息香酸、肉桂酸、丙二酸、葡萄糖酸等，通過(guò)酯鍵形成?；幕ㄉ誟54-56]。?；捎行У刈璧K花青素4種化學(xué)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，?；饔玫挠袡C(jī)芳香酸或脂肪酸對(duì)花青素的穩(wěn)定起到了很大的作用。花色苷中流動(dòng)的糖鏈就像一條帶子將折疊好的?；p繞在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，這種堆積作用不僅對(duì)花青素具有保護(hù)作用，而且對(duì)系統(tǒng)的色澤穩(wěn)定性具有積極的作用，稱(chēng)為花青素的“三明治”結(jié)構(gòu)[57]。酰基平面碳鏈殘基和花青素核之間疏水作用力形成層狀結(jié)構(gòu)，較好地保護(hù)了夾在兩個(gè)有機(jī)酸中間的花青素核，使其能夠較好地抵抗親水攻擊和其它類(lèi)型的降解反應(yīng)[58]。

對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行了一系列脂肪酸?；揎棧瑢?duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行?；昂蟮牟煌瑴囟确€(wěn)定性研究結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 藍(lán)莓花青素?；昂鬁囟确€(wěn)定性Fig.3 Temperature stability before and after acylation of blueberry anthocyanins

由圖3可知，藍(lán)莓花青素被?；螅瑩碛懈叩臒崮褪苄裕貏e是加熱4 h后是很顯著的。在80℃～100℃下，加熱10 h，?；乃{(lán)莓花青素保留率高達(dá)50.18%，而未被?；乃{(lán)莓花青素保留率僅為22.27%[59]。

圖4是對(duì)藍(lán)莓花青素進(jìn)行酰化前后光穩(wěn)定性研究結(jié)果。

由圖4可知，藍(lán)莓花青素被酰化后，擁有更高的光穩(wěn)定性，光照10 d后?；乃{(lán)莓花青素保存率在65%以上，而未被酰化的藍(lán)莓花青素保存率僅為60%。避光保存，對(duì)藍(lán)莓花青素和酰化的花青素都是最好的儲(chǔ)存方法[60]。

圖4 藍(lán)莓花青素酰化前后光穩(wěn)定性Fig.4 Light stability before and after acylation of blueberry anthocyanin

花青素骨架和糖基上都帶有自由的羥基，羥基使得花青素不穩(wěn)定，羥基被酰化后，可以提高花青素的穩(wěn)定性。研究表明，?；乃{(lán)莓花青素對(duì)光和熱的穩(wěn)定性，是隨著脂肪酸碳鏈的增長(zhǎng)而增加，當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)到8以后，穩(wěn)定性變化不顯著；當(dāng)脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度一樣時(shí)，多元酸比一元酸更穩(wěn)定。

4 展望

隨著人們生活水平的日益提高，人們?cè)絹?lái)越重視健康和回歸自然，越來(lái)越青睞天然食品，大力開(kāi)發(fā)利用天然花青素等植物色素以及提高其穩(wěn)定性已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。依據(jù)花青素的結(jié)構(gòu)和特性，通過(guò)不同的技術(shù)手段來(lái)提高花青素的穩(wěn)定性，使其具有更廣闊的應(yīng)用前景是將來(lái)發(fā)展的必由之路。