和血明目片對激光誘導小鼠脈絡膜新生血管的治療作用*

張宇飛 宋俊伯 危冬昱 龍 盤 李曼紅 高錦成 周 健 陳 濤 張作明

(1. 空軍軍醫大學航空航天臨床醫學中心，西安 710032)(2. 空軍軍醫大學基礎醫學院，西安 710032)(3. 中國人民解放軍西部戰區總醫院眼科，成都 610083)(4. 空軍軍醫大學第一附屬醫院西京醫院眼科，西安 710032)(5. 陜西省中醫醫院，西安 710082)

脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)相關疾病是目前眼科領域內主要的致盲性疾病之一，主要以病理性增殖性新生血管形成為特征，易患人群十分廣泛，是目前亞洲地區甚至發達國家致視力損傷的主要疾病之一[1-3]。目前臨床上對CNV相關疾病的治療還缺乏較為有效的方法，主要采用抗VEGF治療、激光光凝、光動力治療、經瞳孔溫熱療法等對癥緩解治療[4-7]。隨著國內外中醫藥研究的發展，發現越來越多的中醫藥在許多難以攻克的疾病上有著良好的治療效果[8]，已有研究表明許多中藥對CNV相關疾病也有著一定的療效[9]。和血明目片作為眼科常用的中成藥之一，被廣泛用于臨床治療糖尿病視網膜病變、高血壓眼底出血和年齡相關性黃斑變性等眼科血管性疾病[10-11]。但是，目前尚缺乏相關動物實驗基礎及相應機制研究證據。因此，本實驗旨在從動物實驗角度出發研究和血明目片對CNV 的治療效果，為下一步開展機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，空軍軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0045，實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2017-0021，SPF級環境下常規飼養，提供充足飲食，明暗交替12 h /12 h。實驗動物的飼養和使用符合視覺與眼科研究協會制定的科研動物使用規范。

1.2 藥物與試劑

和血明目片(西安碑林藥業股份有限公司)；戊巴比妥鈉、FITC標記凝集素(美國Sigma公司)；陸眠寧(吉林省華牧動物保健品有限公司)；熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司)；復方托吡卡胺滴眼液、加替沙星眼用凝膠(沈陽興齊眼藥股份有限公司)；鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥有限公司)。

1.3 主要儀器

視覺電生理檢查儀(德國羅蘭)；同步共焦激光眼底熒光造影儀(德國海德堡)；577 nm倍頻Nd：YAG 激光器(美國科醫人)。

1.4 方法

1.4.1動物分組：動物適應3 d后進行隨機分組，分為對照組、生理鹽水組、小劑量組、中劑量組和大劑量組，每組6只。

1.4.2CNV造模方法：小鼠常規腹腔注射麻醉(3 mL/kg、1%戊巴比妥鈉)，復方托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙燈下通過角膜接觸鏡將倍頻577 nm Nd：YAG激光(能量180 mW、光斑100 μm、曝光時間100 ms)導入眼內，在距離視盤1～2 PD處圍繞視盤擊射視網膜，每只小鼠雙眼擊射6個光凝點。光凝后以有小氣泡產生為準，可伴輕響或少量出血，表示已經擊破Bruch膜。

1.4.3干預及治療方法：激光造模后第2天開始給藥，對照組與生理鹽水組10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，小劑量組、中劑量組和大劑量組每日分別給予0.34 g/(kg·d)、0.68 g/(kg·d)、1.36 g/(kg·d)和血明目片灌胃(藥物以生理鹽水溶解)。

1.4.4視網膜電圖(electroretinogram，ERG)記錄方法[8]：參照本實驗室建立的小動物ERG記錄標準化方案對實驗動物右眼進行ERG檢測。具體方法如下：檢測前，將實驗動物提前放入小動物暗適應箱中進行12 h暗適應，隨后在微弱的紅光下進行實驗動物常規腹腔注射麻醉(3 mL/kg、1%戊巴比妥鈉+50 μL、10%陸眠寧)，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，鹽酸奧布卡因滴眼液角膜表面麻醉后，安放電極(記錄電極為Ag-AgCl角膜環狀電極，參考電極為不銹鋼頰部針狀電極，接地電極為不銹鋼尾部針狀電極)，隨后進行ERG相應指標的記錄，記錄結束后取下電極，并給予加替沙星眼用凝膠涂眼。

1.4.5熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)：小鼠行ERG檢查后將20%熒光素鈉溶液(0.5 mL/kg)自腹腔注入，于注射后1～2 min期間采集FFA圖像。熒光素滲漏強度根據Takehana等[12]的實驗方法進行分級，分級標準如下：0級為無滲漏、1級為輕度滲漏、2級為中度滲漏、3級為重度滲漏。

1.4.6脈絡膜鋪片新生血管染色：參照文獻[15]報道方法進行脈絡膜鋪片新生血管染色，具體方法如下：過量麻醉處死小鼠后取出眼球，置于4%多聚甲醛內浸泡1 h，顯微鏡下以赤道部為界去除前節及神經視網膜層，在脈絡膜復合體上作4～6條放射性切口，用自制漂洗液(0.2 mL tween 20，0.5 g BSA，溶于100 mL PBS中)漂洗5 min重復5次后，利用FITC標記凝集素B4(10 μg/mL)室溫25 ℃孵育4 h，自制漂洗液漂洗5 min重復5次后，DAPI染核15 min后洗去DAPI，甘油封片。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 和血明目片對CNV小鼠視網膜功能的影響

ERG是一項客觀反映視網膜功能的指標。如圖1和圖2所示，與對照組相比，各干預組CNV小鼠視網膜功能均下降，表現為暗視3.0 ERG反應b波幅值降低(P<0.05)。此外，和血明目片對CNV小鼠視網膜功能具有保護作用，表現為和血明目片干預的實驗組與生理鹽水組相比，暗視3.0 ERG反應b波幅值相對較高(P<0.05)。并且和血明目片對CNV小鼠視網膜的保護作用存在明確的量效關系(圖2)。

圖1 實驗動物暗視3.0 ERG反應典型波形Fig.1 Typical scotopic 3.0 ERG of experimental animals

圖2 各組實驗動物暗視3.0 ERG反應b波幅值比較注：*P<0.05,**P<0.01Fig.2 Comparison of the b-wave amplitudes of scotopic 3.0 ERG in each groupNote：*P<0.05,**P<0.01

2.2 和血明目片對CNV小鼠FFA檢查結果的影響

眼底血管造影是臨床檢查眼底血管異常的金標準。如圖3所示，與對照組小鼠相比，各組CNV小鼠眼底存在不同程度的強熒光滲漏，其中和血明目片干預組(圖3A、B、C)的滲漏明顯輕于生理鹽水組(圖3D)。根據Takehana等[14]的實驗方法進行分級評估的結果顯示(表1)，與生理鹽水組相比，和血明目片干預后CNV眼底滲漏程度(P<0.05)。

圖3 實驗動物眼底FFA造影圖像注：A.小劑量組；B.中劑量組；C.大劑量組；D.生理鹽水組；E.對照組Fig.3 Images of fluorescein fundus angiography (FFA) of experimental animalsNote： A. Low dose group; B. Medium dose group;C. High dose group; D. Saline group;E. Control group

表1 各組實驗動物眼底FFA熒光造影滲漏點分析情況Table 1 Analysis of leakage point of fluorescein fundus angiography (FFA) in each group

2.3 和血明目片對CNV小鼠脈絡膜新生血管形成的影響

脈絡膜鋪片新生血管染色是CNV病理診斷的金標準。如圖4所示，與對照組小鼠相比，各組CNV小鼠脈絡膜鋪片上激光光斑周圍均出現不同程度的新生血管(圖4中FITC標記的綠光熒光)，其中和血明目片干預組(圖4A、B、C)與生理鹽水組(圖4D)相比，新生血管較少，表現為和血明目片干預組脈絡膜鋪片新生血管明顯少于生理鹽水組(圖5，P<0.05)。

圖4 實驗動物脈絡膜鋪片新生血管染色圖像注：A.小劑量組；B.中劑量組；C.大劑量組；D.生理鹽水組；E.對照組Fig.4 Images of flat mounts of choroidal neovascularizationNote：A. Low dose group; B. Medium dose group; C. High dose group; D. Saline group; E. Control group

圖5 各組實驗動物CNV面積比較注：*P<0.05Fig.5 Comparison of CNV area in each groupNote: *P<0.05

3 討論

CNV也稱視網膜下新生血管，是一種起源于脈絡膜血管的異常血管，其誘因主要與外傷、炎癥、腫瘤等一系列因素相關。CNV形成后由于血管壁通透性高于正常血管，極易導致出血、滲出以及瘢痕的形成，最終導致視力的受損甚至致盲。本實驗研究證實了和血明目片可以有效抑制激光誘導CNV小鼠模型脈絡膜新生血管的形成。由于血管壁通透性高的新生血管形成減少，因此和血明目片干預組CNV小鼠眼底血管滲漏相對較輕。脈絡膜是眼內血流最豐富的組織，主要負責視網膜外五層的營養支持。當發生CNV時，局部脈絡膜循環將發生障礙，最終影響到脈絡膜供血的外層視網膜功能，而表現出ERG反應幅值的下降。和血明目片因有效的抑制了CNV的產生，改善了脈絡膜局部循環狀態，最終保護了視網膜的功能。

和血明目片主要成分中的地黃、墨旱蓮、牡丹皮具有涼血止血的功效，丹參、川芎、赤芍、郁金和茺蔚子等具有涼血破瘀的功效，菊花、牡丹皮、女貞子等具有養肝明目的功效，能夠保護視網膜細胞功能以及促進炎性滲漏吸收[14-15]。這些成分都可能是其抑制CNV形成的物質，但是其具體機制尚不明確。CNV的形成受到多方面因素的影響，與其相關的信號分子包括VEGF、bFGF、HIF-1等[16-17]。除此之外，與其發病相關的因素還包括各種細胞的參與，以及多種生物因子的作用。和血明目片究竟是通過哪一種(或幾種)機制發揮治療作用還需進一步研究。

綜上所述，本研究從動物實驗角度出發證實了和血明目片對CNV 具有一定的治療效果，為和血明目片在CNV相關疾病的臨床應用提供了實驗依據，同時也為下一步研究其具體機制奠定了基礎。