中縫核miR-16與5-羥色胺轉運體在失眠模型大鼠中的表達

方芳 羅伏鋼 宋明芬 李靜 劉文娟 胡霖霖 李梅 張永華 邵瓊琰

[摘要] 目的 研究中縫核miR-16以及5-羥色胺轉運體（serotonin transporter，SERT）的表達在失眠癥發病機制中的作用。 方法 20只雌性SD大鼠，隨機分成對照組和失眠組。失眠組大鼠接受腹腔注射對氯苯丙氨酸（p-chlorophenalanine，PCPA）350 mg/（kg·d），連續3 d，對照組給予等量生理鹽水。取中縫核組織，測定其miR-16、SERT mRNA與SERT蛋白水平，進行注射前后的組間比較。 結果 失眠組大鼠中縫核miR-16相對水平（1.23±0.33）與對照組（0.71±0.25）比較明顯升高，差異具有統計學意義（t=6.68，P=0.000）;而失眠組SERT mRNA相對水平（0.68±0.14）以及SERT蛋白相對水平（0.28±0.11）顯著低于相應的對照組（1.06±0.30，0.57±0.15）（t=3.94，P=0.004;t=4.69，P=0.002）。 結論 中縫核miR-16以及SERT的異常表達，可能參與了失眠癥的發病機制。

[關鍵詞] 失眠;miR-16;5-羥色胺轉運體;中縫核

[中圖分類號] R74? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0034-04

Expression of raphe nuclei miR-16 and serotonin transporter in insomnia model rats

FANG Fang1? ?LUO Fugang2? ?SONG Mingfen3? ?LI Jing3? ?LIU Wenjuan4? ?HU Linlin4? ?LI Mei4? ?ZHANG Yonghua4? ?SHAO Qiongyan5

1.Emergency Room， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou? ?310013， China; 2.Department of Geriatrics， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou? ?310013， China; 3.Molecular Biology Laboratory， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou 310013， China; 4.Department of Psychophysiology， Hangzhou Seventh People's Hospital， Hangzhou? ?310013， China; 5.Third Clinical College， Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? 310053， China

[Abstract] Objective To study the role of raphe nuclei miR-16 and serotonin transporter（SERT） expression in the pathogenesis of insomnia. Methods Twenty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and insomnia group. Rats in the insomnia group received intraperitoneal injection of p-chlorophenalanine（PCPA） 350 mg/（kg·d） for 3 days， and the control group was given the same amount of saline. The raphe nuclei tissue was taken and the levels of miR-16， SERT mRNA and SERT protein were measured， and the comparison between groups before and after injection was performed. Results The relative level of miR-16 in the raphe nuclei（1.23±0.33） of the insomnia group was significantly higher than that in the control group（0.71±0.25）. The difference was statistically significant（t=6.68， P=0.000）. The relative levels of SERT mRNA （0.68±0.14） and SERT protein （0.28±0.11） in insomnia group were significantly lower than those（1.06±0.30， 0.57±0.15） of the corresponding control group（t=3.94， P=0.004; t=4.69， P=0.002）. Conclusion Abnormal expression of miR-16 and SERT in the raphe nuclei may be involved in the pathogenesis of insomnia.

[Key words] Insomnia; miR-16; Serotonin transporter; Raphe

當今社會失眠發病率不斷攀升，據報道失眠的發病率高達10%[1，2]，已成為危害身心健康的社會公共衛生問題[3]。但是失眠的發病機制未明。現有研究提示，失眠的發病機制與5-羥色胺（5-HT）系統功能低下有關[4，5]。5-羥色胺轉運體（serotonin transporter，SERT）分布于神經突觸前膜，從突觸間隙中回收5-HT，起到調節突觸間隙5-HT濃度的作用，決定與突觸后受體結合的5-HT量和作用持續時間，在5-HT神經傳遞系統中起關鍵作用[6]。目前研究表明，SERT基因是miR-16的靶基因[7-9]。但是失眠癥miR-16及其靶基因SERT的表達水平尚不清楚。本次實驗建立對氯苯丙氨酸（p-chlorophenalanine，PCPA）大鼠失眠模型，檢測中縫核miR-16與SERT水平，探討miR-16及其靶基因SERT的表達在失眠癥發病機制中的作用，為進一步了解失眠癥的5-HT機制提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

清潔級健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（浙）2014-0001，8周齡，體重約250 g。飼養室溫度控制在（25±1）℃， 相對濕度為（55±5）%，12 h/12 h明暗交替照明，自由飲水和攝食。實驗前適應性飼養1周。

1.2 方法

1.2.1 動物處理? 20只SD大鼠按隨機數字表法分成對照組和失眠組。大鼠失眠模型的建立參照以往的研究進行[10]。PCPA（購自美國Sigma公司），用生理鹽水制成混懸液，現用現配。失眠組大鼠腹腔注射PCPA劑量為350 mg/kg，體積為10 mL/kg，1次/d，連續3 d。對照組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 大鼠一般狀況觀察? 觀察兩組大鼠一般狀況，包括精神狀態、對應激的反應情況、毛發情況、日間與夜晚活動情況等。

1.2.3 造模成功的判斷? 采用戊巴比妥鈉翻正實驗判斷。在第3次注射后36 h，兩組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉（購自美國Sigma公司）50 mg/kg（引起所有大鼠睡眠的最小域劑量），將大鼠腹部朝上平放，以翻正反射消失為發生睡眠，以翻正反射恢復為覺醒[10]，記錄大鼠的睡眠潛伏期及睡眠持續時間。若大鼠白天與夜晚都頻繁活動，且戊巴比妥鈉翻正實驗中對照與失眠組的睡眠潛伏期、睡眠持續時間比較有統計學差異，則造模成功。

1.2.4 中縫核取材? 戊巴比妥鈉翻正實驗結束后，斷頭處死大鼠，剪開顱骨，分離腦組織置于冰上，從腦干中切取中縫核，-80℃冷凍待測miR-16、SERT mRNA和SERT蛋白。

1.2.5 實時熒光定量PCR法測定miR-16? 通過總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取中縫核總RNA，用Nanodrop（美國thermo scientific公司）測定濃度和純度;取2 μg總RNA用cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]反轉錄成cDNA，然后進行實時定量熒光PCR擴增測定miR-16水平，miRNAs熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自天根生化科技（北京）有限公司。miR-16正向引物：5'-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3'。反向引物從miRNAs熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）中獲得，序列未顯示。PCR擴增程序為：94℃ 2min預變性;然后94℃ 20s，52℃ 30s，72℃ 30s，循環35次。熒光PCR儀購自ABI公司，型號Stepone Plus，獲得Ct值，并根據內參U6計算miR-16的相對含量。

1.2.6 實時熒光定量PCR法測定中縫核SERT mRNA水平? 上述獲得的cDNA采用SYBR Green法測定SERT mRNA水平，熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自大連TaKaRa公司，步驟按照說明書進行。使用β-actin作為內參，得出大鼠中縫核組織中SERT mRNA的相對表達水平。

1.2.7 Western blot法測定SERT蛋白? 使用總蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術公司）提取中縫核組織的總蛋白，并且通過BCA法（碧云天生物技術公司）對蛋白進行定量。SERT抗體以及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自Santa Cruz公司。使用ChemiDocTM XRS+分子成像儀（美國Bio-rad公司）進行蛋白條帶分析，并用內參β-actin校正，得出相對SERT蛋白的相對水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析。注射前失眠組和對照組之間比較、注射后失眠組和對照組之間比較采用成組t檢驗;失眠組在注射前后比較、對照組在注射前后比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

對照組大鼠精神狀態良好，活動機靈，反應敏捷，毛發有光澤。失眠組大鼠精神亢奮，易激惹，毛發光澤較對照組差，日間與夜晚皆活動不斷。

2.2 大鼠失眠模型的評定

失眠組睡眠潛伏期明顯長于對照組（P<0.01），而睡眠持續時間明顯短于對照組（P<0.01）。見表1。

表1? ?戊巴比妥鈉翻正實驗結果（x±s，min）

2.3 兩組大鼠中縫核miR-16水平變化

PCPA注射前，失眠組miR-16相對含量（0.69±0.17）與對照組（0.76±0.21）比較無明顯差異（t=1.45，P=0.190）;注射后，失眠組miR-16相對含量（1.23±0.33）明顯高于對照組（0.71±0.25），差異有統計學意義（t=6.68，P=0.000）。見圖1。

圖1? ?PCPA注射前后兩組中縫核miR-16水平變化

2.4 兩組大鼠中縫核SERT mRNA變化

PCPA注射前，失眠組SERT mRNA相對含量（1.20±0.28）與對照組（1.14±0.36）比較，差異無統計學意義（t=0.39，P=0.700）;注射后，失眠組SERT mRNA相對含量（0.68±0.14）明顯低于對照組（1.06±0.30），差異有統計學意義（t=3.94，P=0.004）。見圖2。

圖2? ?PCPA注射前后兩組大鼠SERT mRNA水平變化

2.5 兩組大鼠中縫核SERT蛋白表達變化

PCPA注射前，失眠組SERT 蛋白相對含量（0.62±0.23）與對照組（0.51±0.15）比較無顯著差異（t=1.50，P=0.170）;注射后，失眠組SERT 蛋白相對含量（0.28±0.11）明顯低于對照組（0.57±0.15），差異有統計學意義（t=4.69，P=0.002）。見圖3。

3討論

針對失眠癥患者5-HT神經遞質功能低下的特點，臨床上選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類藥物（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）通常用于失眠癥的治療，且獲得較好的臨床療效[11，12]。SSRIs類藥物以SERT為作用靶點，通過抑制SERT對突觸間隙5-HT的再回收，提高突觸間隙5-HT水平，進而增強5-HT系統功能而發揮其藥理學作用[13]。本次研究結果表明，失眠大鼠的SERT mRNA與SERT蛋白表達水平均顯著低于對照組，提示SERT參與了失眠的發生和發展。分析SERT表達下降的原因可能為失眠大鼠的5-HT功能下降，突觸間隙5-HT水平降低，使SERT反饋性低表達，以減少5-HT從突觸間隙再攝取至突觸前神經元內，從而增加和突觸后膜上5-HT受體結合的5-HT量。

越來越多的證據表明，miRNAs在腦組織中呈特異性表達，它們可能在大腦神經可塑性以及腦功能發揮中起重要作用[14]，同時，它們可能參與了諸多精神疾病如抑郁癥的表觀遺傳學機制和藥物治療機制[15，16]。有研究指出，miRNAs可能參與調節晝夜節律，因而與失眠相關。CLOCK基因在晝夜節律調控方面發揮重要作用，miR-182對該基因的表達具有調節作用[17];另外，miR-219-1/132/183/96/182也參與了生物鐘的調節[18]。Saus等[19]發現pre-miR-182的rs76481776位點T等位基因與抑郁癥患者的失眠相關。在治療方面，miR-101a被發現參與針灸治療失眠的作用機制[20]。多項研究指出，SERT基因表達受miR-16的調節，miR-16與SERT mRNA的3非翻譯區（3-untranslated region，UTR）結合，引起mRNA的降解，抑制基因翻譯，從而在翻譯水平調節SERT表達[21-24]。有學者對miR-16與抑郁癥的關系方面進行了闡明，母愛剝奪抑郁模型大鼠海馬miR-16水平明顯高于對照組大鼠，且miR-16的高低與抑郁行為相關[25];抗抑郁藥氟西汀能降低小鼠海馬組織miR-16，如果使用人工合成的抗miR-16對miR-16進行中和，則小鼠亦表現出抑郁樣行為[26]。但是，miR-16是否與失眠癥相關，至今相關的報道較少。本次研究發現，miR-16在失眠模型大鼠中表達升高，提示miR-16作為SERT基因的調節因子，可能通過介導SERT基因的表達調節，發揮其在失眠癥中的作用。。

本研究存在不足。（1）本次實驗選用雌性大鼠作為研究對象。研究提示，失眠癥存在性別差異[27]，臨床上失眠癥患者女性多于男性，本次研究采用雌性大鼠作為研究對象，今后需對雄性大鼠進行相關研究，以明確不同性別間的差異。（2）因中縫核與5-HT系統功能密切相關，本次實驗只對5-HT能神經元聚集的中縫核進行了研究，今后有待對失眠癥相關的其他腦區進行研究。

總之，本次實驗提示失眠模型大鼠中縫核miR-16、SERT基因表達發生異常，miR-16可能通過參與改變SERT蛋白水平，從而調節體內5-HT遞質系統，參與失眠癥的發病機制。

[參考文獻]

[1] 王宏展，董慧. 黃連復方治療原發性失眠研究進展[J]. 湖北中醫雜志，2018，40（5）： 64.

[2] 張翼，廖遠高. 舍曲林聯合右佐匹克隆治療失眠伴抑郁焦慮[J]. 實用醫藥雜志，2018，35（3）：240-242.

[3] 趙雅娟，符浩，王勇. 網絡化認知行為治療在睡眠障礙中的應用[J]. 上海交通大學學報（醫學版），2018，38（5）：556-560.

[4] 高巖，趙亞明，馬辛. 米氮平與度洛西汀對老年抑郁癥失眠者的療效及5-HT的影響[J]. 西北藥學雜志，2018， 33（2）：241-244.

[5] 李勇，李恒飛. 調任通督針法聯合疏肝安神湯治療失眠的療效及對5-羥色胺和多巴胺水平的影響[J]. 現代中西醫結合雜志，2017，26（32）：3561-3563，3594.

[6] 張煥，劉薇. 強迫癥候選基因的研究新進展[J]. 神經疾病與精神衛生，2018，18（2）： 102-108.

[7] Issler O，Chen A. Determining the role of microRNAs in psychiatric disorders[J]. Nat Rev Neurosci，2015，16（4）：201-212.

[8] Farazi TA，Hoell JI，Morozov P，et al. MicroRNAs in human cancer[J]. Adv Exp Med Biol， 2013，774：1-20.

[9] Dwivedi Y. Evidence demonstrating role of microRNAs in the etiopathology of major depression[J]. J Chem Neuroanat，2011，42（2）：142-156.

[10] 武靜，王慧，史琴，等. PCPA失眠大鼠不同時間皮質前額葉ATP水平變化及酸棗仁湯的干預作用[J]. 重慶醫學，2017，4（4）：439-441.

[11] 余正和，王晟東，宋明芬，等. 帕羅西汀聯合唑吡坦治療原發性失眠的臨床療效與安全性[J]. 中國臨床藥理學雜志，2015，32（9）：771-773.

[12] 毛洪京，徐蓮蓮，劉義. 艾司西酞普蘭聯合唑吡坦治療原發性失眠的臨床療效和安全性評價[J]. 中國臨床藥理學雜志，2015，31（5）：339-341.

[13] Nackenoff AG，Moussa-Tooks AB，McMeekin AM，et al. Essential contributions of serotonin transporter inhibition to the acute and chronic actions of fluoxetine and citalopram in the SERT Met172 mouse[J]. Neuropsychopharmacology，2016，41（7）：1733-1741.

[14] Petri R，Malmevik J，Fasching L，et al. miRNAs in brain development[J]. Exp Cell Res， 2014，321（1）：84-89.

[15] Serafini G，Pompili M，Hansen KF，et al. The involvement of microRNAs in major depression，suicidal behavior，and related disorders： a focus on miR-185 and miR-491-3p[J]. Cell Mol Neurobiol，2014，34（1）：17-30.

[16] Baudry A，Mouillet-Richard S，Schneider B，et al. miR-16 targets the serotonin transporter：A new facet for adaptive responses to antidepressants[J]. Science，2010，329（5998）：1537-1541.

[17] Nirvani M，Khuu C，Utheim TP，et al. Circadian rhythms and gene expression during mouse molar tooth development[J]. Acta Odontol Scand，2017，75（2）：144-153.

[18] Hansen KF，Sakamoto K，Obrietan K. MicroRNAs：A potential interface between the circadian clock and human health[J]. Genome Med，2011，3（2）：10.

[19] Saus E，Soria V，Escaramis G，et al. Genetic variants and abnormal processing of pre-miR-182，a circadian clock modulator，in major depression patients with late insomnia[J]. Hum Mol Genet，2010，19（20）：4017-4025.

[20] Bo A，Si L，Wang Y，et al. Mechanism of Mongolian medical warm acupuncture in treating insomnia by regulating miR-101a in rats with insomnia[J]. Exp Ther Med，2017，14（1）： 289-297.

[21] Moya PR，Wendland JR，Salemme J，et al. miR-15a and miR-16 regulate serotonin transporter expression in human placental and rat brain raphe cells[J]. Int J Neuropsychopharmacol，2013，16（3）：621-629.

[22] Murphy DL，Moya PR. Human serotonin transporter gene（SLC6A4） variants：Their contributions to understanding pharmacogenomic and other functional GxG and GxE differences in health and disease[J]. Curr Opin Pharmacol，2011，11（1）：3-10.

[23] Yang Y，Hu Z，Du X，et al. miR-16 and fluoxetine both reverse autophagic and apoptotic change in chronic unpredictable mild stress model Rats[J]. Front Neurosci，2017， 11：428.

[24] Tamarapu Parthasarathy P，Galam L，Huynh B，et al. MicroRNA 16 modulates epithelial sodium channel in human alveolar epithelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2012， 426（2）：203-208.

[25] Bai M，Zhu X，Zhang Y，et al. Abnormal hippocampal BDNF and miR-16 expression Is associated with depression-like behaviors induced by stress during early life[J]. PLoS One，2012，7（10）：e46921.

[26] Launay JM，Mouillet-Richard S，Baudry A，et al. Raphe-mediated signals control the hippocampal response to SRI antidepressants via miR-16[J]. Transl Psychiatry，2011， （1）： e56.

[27] 張蕾，和申，余一旻，等. 原發性失眠人群特征、睡眠質量及危險因素的研究[J]. 上海交通大學學報（醫學版），2016，36（5）：689-694.

（收稿日期：2018-12-28）