張開文 從睿 王定躍

摘要：? 本文從外植體選擇、外植體的滅菌方式、基本培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇、生根培養(yǎng)基的選擇、生根苗的移栽這幾個方面歸納總結(jié)了國內(nèi)有關(guān)杜鵑屬植物組培快繁應(yīng)用的研究進(jìn)展，并提出了目前存在問題與發(fā)展利用前景。

關(guān)鍵詞：? 杜鵑;? 組培快繁;? 研究進(jìn)展

中圖分類號：? ?S 68， S 604? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2020）01 - 0029 - 05

杜鵑屬（Rhododendron）為杜鵑花科中最大屬，也是中國和喜馬拉雅植物區(qū)系中的大屬之一，約960種，廣泛分布于亞歐、北美，以東亞和東南亞為分布中心和主產(chǎn)區(qū)。我國約542種杜鵑屬植物，集中產(chǎn)于西南、華南。該屬多喬、灌木，植株多被毛或鱗片，葉互生全緣，花芽被多數(shù)芽鱗，花傘形總狀或短總狀花序，蒴果自頂部向下室間開裂，種子多且小[ 1 ]。杜鵑是世界名花之一，也是中國十大傳統(tǒng)名花之一，具有很強(qiáng)的觀賞價值，因此各地開展了許多以杜鵑為主題的活動，如“江蘇無錫的中國杜鵑園”、“湖南湘潭的盤龍杜鵑園”、“天臺山云錦杜鵑節(jié)”、“扎蘭屯杜鵑花節(jié)”等。除此之外，杜鵑的花還具有食用價值，樹干可用作木材，杜鵑還可入藥，可謂渾身都是寶。

杜鵑常見的繁殖方式有種播、扦插、嫁接、壓條等[ 2 ]，這些方式各具局限性，嚴(yán)重制約了我國杜鵑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度。組培快繁是基于細(xì)胞全能型基礎(chǔ)建立起來的，在杜鵑屬植物上運用組培快繁技術(shù)，不僅能夠克服季節(jié)因素對繁殖的限制，也能為市場帶來大批規(guī)整優(yōu)良的苗木。

1 杜鵑組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀

1. 1 外植體的選擇

在選擇杜鵑屬植物外植體時，考慮到杜鵑屬植物多為多年生小喬木或灌木，枝條、葉片、芽鱗、果實多被有腺毛、綿毛，且材料體積較大，所以外植體的取材部位、所處的發(fā)育階段、材料的生理年齡均可影響組織培養(yǎng)的進(jìn)展程度與后繼快速擴(kuò)繁的成敗。因此，杜鵑屬常用的外植體材料有莖段、莖尖、頂芽、側(cè)芽、花苞、種子、葉片等。

目前，杜鵑屬植物的組培與擴(kuò)繁采用的外植體多為莖段、莖尖。董春枝等[ 3 ]選用錦繡杜鵑（Rhododendron pulchrum）、迎紅杜鵑（Rhododendron mucronulatum）、映山紅（Rhododendron simsii），利用這3種植物的早春花后新發(fā)幼莖培養(yǎng)出的莖尖作為外植體，成功擴(kuò)繁出大量的試管苗植株。朱春艷等[ 4 ]和蘇家樂等[ 5 ]利用杜鵑當(dāng)年新發(fā)的莖段或莖尖，獲得了較高的試管苗成活率。陳平芬等[ 6 ]和顧地周等[ 7 ]則利用杜鵑屬1年生半木質(zhì)化莖段部分進(jìn)行擴(kuò)繁，這也成為擴(kuò)繁杜鵑植物的一種方式。

運用頂芽和側(cè)芽建立杜鵑屬植物的組培繁殖體系也較為成熟。王亦菲等[ 8 ]選取西洋杜鵑兩種栽培品種（Rhododendron britannia和Rhododendron america）的頂芽和側(cè)芽，成功誘導(dǎo)出再生芽，且增殖出根系。林魁等[ 9 ]和高航洋等[ 10 ]也利用杜鵑屬新萌發(fā)的嫩芽，取得了杜鵑試管苗植株。

王蔚瓊等[ 11 ]用高山杜鵑（Rhododendron lapponicum） “粉冠博士”的花苞成功誘導(dǎo)出了不定芽，并且順利擴(kuò)繁出杜鵑試管苗。趙富群等[ 12 ]和鄭茜子等[ 13 ]利用杜鵑屬的種子培養(yǎng)發(fā)芽后，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。

葉片的采集相對不受季節(jié)的限制，所以有部分研究者選其為外植體材料。劉淼等[ 14 ]和張楊軍等[ 15 ]利用杜鵑屬的植物葉片誘導(dǎo)出愈傷組織，并培育出組培苗。

由于杜鵑屬植物的成熟莖干、葉片的表面覆毛被且有粘液，清洗難度較高，所以不常使用，而常選取幼嫩莖段、莖尖進(jìn)行試驗，且可以直接分化成芽，試驗成功率較高。運用花蕾和種子作為外植體材料受到采集時間的限制，但也可成功建立起杜鵑屬的無性繁殖體系。

1. 2 外植體的滅菌方式

針對杜鵑屬植物的共有屬性，研究者選取的外植體滅菌方式大致相同。根據(jù)研究杜鵑種類、選取外植體材料、實際操作條件等不同，制定了具有針對性的滅菌方法。

首先，將外植體進(jìn)行簡單處理后用清水沖洗10～30 min，再用一定濃度的洗衣液或洗衣粉等洗滌劑浸泡10～30 min，種子作為外植體可浸泡1 h，再用清水沖洗0.5～2 h。

然后，大多數(shù)研究者在無菌操作臺上采用“三步法”繼續(xù)對外植體進(jìn)行滅菌，在滅菌溶液、滅菌時間、重復(fù)次數(shù)等操作上總結(jié)出最適合的方式。第一步，用70%～75%的酒精浸泡外植體，一般浸泡30～

60 s不等，也有將芽浸泡在70%酒精內(nèi)3 min[ 16 ]、將葉片浸泡在75%酒精內(nèi)3 s[ 17 ]等滅菌時間較長或較短的操作方法，浸泡后用無菌水清洗。第二步，使用一些消毒溶液對外植體進(jìn)行消毒，研究者常將外植體浸泡在1～10%濃度的次氯酸鈣溶液中3～? 15 min，次氯酸鈣溶液中也可混有2%青霉素[ 18 ]、2%鏈霉素[ 7 ]、0.005%洗滌劑[ 34 ]增加清潔與滅菌功能。也有研究者使用5%次氯酸鈣浸泡外植體15 s[ 19 ]、5%青霉素浸泡外植體10 min[ 21 ]、1∶50的新潔爾液浸泡外植體20 min[ 20 ]，處理后用無菌水沖洗1～3次。第三步，大多數(shù)研究者使用0.1%升汞浸泡外植體5～15 min，升汞中也可加入幾滴吐溫-20[ 39 ]、吐溫-80[ 12 ]、0.1% Tritonx-100[ 13 ]等表面活性劑，增加去污能力。也有部分研究者使用0.5%升汞[ 13 ]、10%雙氧水[ 21 ]，以達(dá)到外植體消毒的目的。經(jīng)過這三個步驟后，再次用無菌水沖洗3～8次，用滅菌濾紙吸干水分或自然瀝干，并切除被殺菌消毒損傷的部分。

最后，針對不同外植體部位進(jìn)行不同的試驗預(yù)處理。把莖段切成1.5～2.5 cm，并帶有2～3個芽的材料;將葉片的葉緣切除，葉片切成9 mm2小塊待用[ 17 ];將馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）的開裂蒴果剝開，種子接種于種子培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間至種子萌發(fā)備用[ 22 ]。

1. 3 基本培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是外植體獲得營養(yǎng)的主要渠道，合適的培養(yǎng)基可使外植體進(jìn)行正常的發(fā)育和生長，并能使試驗順利進(jìn)行。針對杜鵑屬植物的基本培養(yǎng)基，研究者多選用MS、1/4MS、WPM、Read等。

紅楓杜鵑（Rhododendron schlippenbachii）[ 23 ]、短果杜鵑（Rhododendron brachycarpum）[ 16 ]等離體培養(yǎng)的成功都是使用MS基本培養(yǎng)基。林魁等[ 19 ]研究高山杜鵑、劉燕等[ 21 ]研究大白杜鵑（Rhododendron decorum）、張艷紅等[ 23 ]研究紅楓杜鵑、顧地周等[ 16 ]研究牛皮杜鵑等都是將1/4 MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，成功誘導(dǎo)分化出杜鵑無菌苗。毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense）[ 12 ]、刺毛杜鵑（Rhodo-dendron championae）[ 4 ]、云錦杜鵑（Rhododendron fortunei）[ 24 ]等都是運用WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)成功的例子。許多研究者使用Read培養(yǎng)基在迎紅杜鵑[ 25 ]、西洋杜鵑[ 8 ]等離體培養(yǎng)中取得成功。

還有研究者選用這些基本培養(yǎng)基：改良MS培養(yǎng)基[ 14 ]、1/2MS培養(yǎng)基[ 6 ]、Anderson培養(yǎng)基[ 11 ]、DR培養(yǎng)基[ 18 ]、ET培養(yǎng)基[ 26 ]。這些基本培養(yǎng)基雖然在杜鵑屬組培中鮮有使用，但也可提供一種研究方法與途徑。

1. 4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

基于適宜的基本培養(yǎng)基之上，在誘導(dǎo)杜鵑叢芽、根莖過程中，還需添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，有時候還會加入無機(jī)營養(yǎng)物、有機(jī)營養(yǎng)物和活性炭等。常用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有生長素類和細(xì)胞分裂素類，主要的作用是促進(jìn)培養(yǎng)物的生長與器官分化，這兩類物質(zhì)加入的比例影響培養(yǎng)物的分化方向。生長素類常用IAA、GA3、2，4-D來誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽與不定芽;用NAA、IBA來誘導(dǎo)生根。細(xì)胞分裂素類常用ZT、TDZ、KT、6BA、2iP來誘導(dǎo)生根。

加入無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)是培養(yǎng)物生長發(fā)育必須的，研究者有時會加入鐵鹽[ 20 ]。在培養(yǎng)過程中，為使培養(yǎng)物的生長與分化順利進(jìn)行，有時還會加入有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、維生素[ 7 ]、氨基酸[ 20 ]等。

田奧磊等[ 27 ]在永福杜鵑培養(yǎng)基中加入活性炭，增加了對有害物質(zhì)的吸附能力，并創(chuàng)造暗環(huán)境有利于培養(yǎng)物生根。部分研究者會在培養(yǎng)基中加入瓊脂，形成膠狀固體培養(yǎng)基。

1. 5 增殖培養(yǎng)基的選擇

對杜鵑屬外植體培養(yǎng)物進(jìn)行誘導(dǎo)分化后，培養(yǎng)物進(jìn)入增殖生長階段。研究者在此階段一般是沿用之前的培養(yǎng)基類型，但徐穎等[ 28 ]將長白山牛皮杜鵑的基本培養(yǎng)基從Read換為MS、顧地周等[ 7 ]將長白山牛皮杜鵑的基本培養(yǎng)基從MS換為1/4 MS、湯桂鈞等[ 38 ]將高山杜鵑的基本培養(yǎng)基從1/4 MS換為1/2 MS，也成功實現(xiàn)了杜鵑屬植物快繁研究。

另外，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度也會有調(diào)整，研究者大多會降低生長素和細(xì)胞分裂素的使用濃度，也有出現(xiàn)調(diào)高濃度的案例，如增加ZT[ 29 ]、NAA[ 30 ]的濃度。

1. 6 生根培養(yǎng)基的選擇

杜鵑屬植物的生根培養(yǎng)基主要為1/2 MS、1/2 WPM、1/4 MS等，植物生長調(diào)節(jié)劑多以IBA、NAA、IAA為主，研究者也會加入活性炭、瓊脂、蔗糖等材料。生根培養(yǎng)基的pH值常調(diào)節(jié)至5～5.6之間，杜鵑培養(yǎng)物的生根率均在93%以上[ 6 ]。

徐穎等[ 28 ]在2010年選擇長白山牛皮杜鵑的生根培養(yǎng)基時，將培養(yǎng)物進(jìn)行試管外生根，用純沙種植20天后，瓶外生根率達(dá)80%。顧地周等[ 16 ]在2008年使用了種質(zhì)試管保存培養(yǎng)基，配比比例為1/6 MS（大量元素） + 1/4 MS（微量元素） + 1/2 MS（鐵鹽） + 1/4 MS （有機(jī)物質(zhì)） + B9 3.5 mg/L。

1. 7 生根苗的移栽

當(dāng)杜鵑組培苗在瓶內(nèi)長至3～4 cm高、不定根達(dá)到3～5個時，可進(jìn)行煉苗。煉苗的方式有多種，一般采取“兩步法”。第一步將組培玻璃瓶移到普通實驗室、人工氣候箱或者自然條件下，瓶蓋從半揭開調(diào)至全揭開，共煉苗7～15天，此過程需保濕、控溫、控水。15天后還可以添加營養(yǎng)液，一般用0.2 %NH4NO3 + 0.2% KH2PO4[ 4 ];也可將苗取出放入河沙中10天進(jìn)行煉苗[ 31 ]。第二步組培苗出瓶，清洗根部后移栽到圃內(nèi)，需要對光照、溫濕度、土壤、水肥藥等基本要素進(jìn)行選擇與控制。用透光率20～25%的塑料薄膜作為棚頂，溫度控制在15～25 ℃，空氣濕度≥85%，土壤材料常用珍珠巖、泥炭、腐殖質(zhì)、蛭石等按體積配比，土壤濕度在65～70%，保持基質(zhì)不發(fā)白、不濕粘。部分研究者選擇噴施多菌靈、廣譜殺菌劑[ 24 ]等殺菌藥物，或者添加0.1%NH4NO3、0.1% KH2PO4、0.1尿素[ 53 ]、Read 100倍稀釋液等營養(yǎng)液，或者加入0.5 mg/L GGR6[ 54 ]等生根劑。經(jīng)過以上的煉苗方式，杜鵑屬植物的組培苗成活率可達(dá)75%以上。

2 杜鵑組培快繁目前存在問題與發(fā)展利用前景

2. 1 目前存在的問題

杜鵑屬植物組培快繁的繁殖方式，雖然能夠快速得到大批量的組培苗，但是它也具有局限性。

杜鵑外植體的滅菌難度較大 杜鵑為多年生木本植物，葉片具毛被或黏液，且體內(nèi)外都有多種微生物，至此加大了杜鵑外植體材料的滅菌難度，后續(xù)培養(yǎng)時容易被污染。

愈傷組織再生的關(guān)卡難以攻破 杜鵑愈傷組織再生是組培快繁的一個重要研究方向，但是現(xiàn)今國內(nèi)外成功的案例不多，可借鑒的情況較少，加大了杜鵑愈傷組織再生的研究難度。

控制外植體有一個合適的增殖系數(shù) 研究證明增值率不是越高越好，增值率高會導(dǎo)致叢生芽細(xì)弱、生長勢下降、退化速度加快。因此，確定合適的增殖系數(shù)十分關(guān)鍵。

預(yù)防外植體褐變和“玻璃化”的發(fā)生 外植體發(fā)生褐變是由于組織中的酚氧化酶被激活后不斷產(chǎn)生醌類物質(zhì)所導(dǎo)致，因此要選擇生長旺盛、材料幼嫩的外植體，同時在培養(yǎng)時可加入Vc、檸檬酸、PVP等物質(zhì)緩解褐變。玻璃苗呈現(xiàn)半透明、含水量高、干物質(zhì)含量低、生根困難，有研究表明瓊脂或蔗糖的濃度與玻璃苗的產(chǎn)生量呈反比，故提高瓊脂或蔗糖濃度可有效降低玻璃化，還可以降低培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度、增加光照、降低細(xì)胞分裂素與GA的濃度。

煉苗時基質(zhì)與肥料的選擇 杜鵑花屬植物的根系主要為極細(xì)的須根，它不耐干也不耐濕，還怕重肥。因基質(zhì)的物理性狀與化學(xué)成分不同，故保水保肥力、透氣性就有差異，選擇合適的基質(zhì)對組培苗具有關(guān)鍵的作用。施肥時要注意薄肥勤施，能淡莫濃。

2. 2 發(fā)展利用的前景

綜合分析前人的研究成果發(fā)現(xiàn)，杜鵑植物的組培應(yīng)用多集中于杜鵑、高山杜鵑、牛皮杜鵑。日后可結(jié)合我國豐富的野生杜鵑植物資源，選取性狀良好、易于推廣的杜鵑種類，加以組培擴(kuò)繁，開發(fā)利用，進(jìn)而豐富杜鵑的應(yīng)用市場。

常用的杜鵑屬植物培養(yǎng)基有MS、1/4 MS、WPM、Read培養(yǎng)基，也可以使用Anderson、1/2 MS、1/2 WPM、DR、ET等培養(yǎng)基來增多杜鵑屬植物培養(yǎng)基的選擇性。

發(fā)展新型組培快繁方式，如樹木微枝試管外生根育苗技術(shù)，該技術(shù)得到的試管外生根苗比試管內(nèi)生根苗具有根系發(fā)育好、根毛多、木質(zhì)化程度高、分化能力強(qiáng)、生長速度快等優(yōu)點，且能夠節(jié)約35～75%的成本。新型組培快繁技術(shù)的建立，為杜鵑屬植物及其優(yōu)良品種的規(guī)模化生產(chǎn)提供了可靠的技術(shù)支持，并為下一步細(xì)胞工程育種、基因工程的開展奠定了基礎(chǔ)。

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第1作者簡介：? 張開文（1990-），? 男，? 碩士，? 工程師，? 主要從事植物資源利用及分類研究。

通訊作者：? 王定躍（1963-），? 男，? 博士，研究員，? 主要從事園林景觀、? 生態(tài)群落方面研究。

收稿日期： 2019 - 12 - 12

（責(zé)任編輯：? ?李 丹）

Research Progress on Tissue Culture and Rapid

Propagation of Rhododendron in China

ZHANG Kaiwen

（Shenzhen Academy of Environmental Science，? Guangzhou Shenzhen 518001）

Abstract In this paper， we summarized the selection of explants， the sterilization method of explants， the selection of basic medium， the selection of induction medium， the selection of rooting medium and the transplanting of rooting seedlings at the research progress of plant tissue culture and rapid propagation application of Rhododendron in China. Then we put forward the current problems， and prospects for development and utilization.At present， the problems are mainly caused by difficulty in sterilization of explants， difficulty in regeneration of callus， prevention of browning of explants and "vitrification". The development and utilization prospects mainly include expanding the species of Rhododendron tissue culture， increasing the selection of culture medium， developing a new type of tissue culture and rapid propagation.

Key words Rhododendron;? Tissue culture and rapid propagation;? Research progress