基于橋聯β-環糊精柱液質聯用法測定臍橙中己唑醇對映體

張天賜，王春燕，鐘 慧，曾慶麗，李來生

(南昌大學化學學院，江西 南昌 330031)

由于生命物質如蛋白質、生物酶和核酸等均為手性物質，與農藥作用時存在高度的立體選擇性，這使得農藥對映體不僅藥效不同，而且毒理和代謝途徑常存在明顯差異[1]。例如三唑類農藥殺菌劑的R-構型殺菌作用強，而S-型殺菌作用弱，且生物降解較慢，殘留在土壤、水體和植物中的對映體最終會對人體健康和生殖帶來嚴重影響[2]。因此，應該科學全面地評價手性農藥殘留對食品安全的影響，并進行對映體含量的監測[3]。

目前，高效液相色譜結合高靈敏度的質譜檢測在農藥殘留監測中的應用日益廣泛[4]，手性分離的關鍵問題是選擇合適的分離材料[5]。目前，纖維素類固定相在農藥拆分中應用較廣，大多在正相色譜條件下拆分[6-7]。環糊精類手性固定相是一類常用的多模式手性固定相，其中包結作用參與手性分離是這類固定相的重要特性[8]。然而由于環糊精空腔較小(～0.65 nm)，所能包結的手性物質有限[9]。近些年來，新型的橋聯環糊精固定相得到了快速發展，它能夠通過多個環糊精腔體協同包結客體[10]，突破了單個環糊精腔體有限的不足，能快速拆分體積較大，數量更多的手性化合物，這也包括手性農藥[11]。

已唑醇屬一種常用高效三唑類手性殺菌劑，甾醇脫甲基化抑制劑，用于防治水稻的紋枯病，也用于各種作物和果樹的白粉病、銹病、黑星病、褐斑病、炭疽病等[12-13]，其手性結構見圖1所示。為此，本文采用實驗室制備的新型橋聯環糊精柱，建立了一種測定臍橙中已唑醇對映體殘留的LC-MS/MS新方法，以滿足食品中手性農藥監測的需要。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Triple TOF 5600+型液質聯用儀(美國AB SCIEX公司)，配有LC30液相色譜系統和Analyst TF 1.7.1數據處理軟件；TGL-16C 型高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ-100DE 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；AR124CN型電子天平(精度0.000 1 g，奧豪斯儀器(常州)有限公司)；MS 3型渦旋儀(德國 IKA公司)；HR1853型果汁機(中國飛利浦公司)；Milli-Q超純水制備裝置(美國Millipore公司)。

己唑醇外消旋標準樣品(純度≥99.5%)購于上海農藥研究院；甲醇(MeOH)、乙腈(ACN) 和甲酸均為色譜級(美國Tedia公司)；四氧化三鐵(Fe3O4)，石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)購自博納艾杰爾科技公司(天津)，其它分析純試劑如無水硫酸鎂(MgSO4)，氯化鈉(NaCl) 等均購于國藥集團上海化學試劑公司，實驗用水為超純水。臍橙樣品從南昌市超市中隨機購買。

2.2 己唑醇標準溶液的配制

稱取一定量的己唑醇外消旋標準品，用甲醇溶解后配制成濃度為400 μg·L-1的儲備液，貯存在冰箱中備用(4 ℃)。使用前用甲醇稀釋成所需濃度：0.5,1,2,4,8,20 μg·L-1，由于外消旋標準品中含有等量的R-和S-對映體，所以每個對映體的濃度為：0.25,0.5,1,2,4,10 μg·L-1，用濾膜過濾后直接進樣分析。

2.3 臍橙樣品的前處理

采用改進的QuEChERS 法[14]進行樣品前處理，盡可能除去臍橙中的色素、脂、果糖和果酸類等干擾物。將臍橙洗凈，切成小塊，然后制成果漿，取10 g果漿于小管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min。然后加入1 g NaCl和4 g無水MgSO4，渦旋1 min后離心5 min，靜置1 min。將上清液轉入含1 g MgSO4的離心管中振搖，靜置分層。移取上層清液1 mL于含40 mg 石墨化炭黑(GCB)、50 mg N-丙基乙二胺填料(PSA)、60 mg Fe3O4磁粒，渦旋1 min，靜置1 min。用外部磁鐵使提取液快速澄清，用濾膜過濾后進樣分析。

2.4 色譜和質譜條件

色譜條件：橋聯β-環糊精柱(250 mm× 4.6 mm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸混合溶液，流速為1 mL·min-1，進樣量為2 μL，柱溫設為20 ℃。

質譜參數：正離子模式下(ESI+)掃描，毛細管電壓+5 500 V，脫溶劑溫度650 ℃，一級質譜掃描范圍：100～400 m/z，二級質譜掃描范圍：60～80 m/z，一級和二級碰撞能量(CE)分別為：10和30 V，定量離子分別為314和70 m/z。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化

3.1.1 流動相組成及酸度的選擇

為了實現己唑醇對映體的快速分離，首先優化流動相的組成，用常見的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸作為流動相。實驗結果發現4種流動相都能實現己唑醇的完全拆分，但甲醇比乙腈分離度更好，且價格較便宜，本實驗選用了甲醇作為有機改性劑。也考察了流動相的酸度對拆分的影響，結果顯示pH值的變化對分離的影響不大，考慮到已唑醇屬堿性農藥，三唑基上多個氮原子易被質子化，有利于提高電噴霧正離子化的效率，從而提高檢測的靈敏度，故選用甲醇-0.1%甲酸作為流動相。甲醇的含量對已唑醇的手性分離度有重要影響，隨著流動相中甲醇含量的提高，分離度是先升后降，綜合考慮分析時間、分離度和檢測靈敏度，流動相的最終組成為甲醇-0.1%甲酸(32:68V/V)。

3.1.2 柱溫的選擇

環糊精手性固定相的空腔結構會受溫度的影響，加之溫度也會影響到已唑醇保留時間、分離度和柱效，最終影響手性農藥的分離效果[14]。實驗發現在室溫附近可實現完全分離，為便于溫度控制，確保己唑醇分離的重現性，本實驗將柱溫設置為20 ℃。

3.1.3 流速和進樣量的選擇

除了上述兩個主要影響因素外，流動相流速和進樣量對分離結果也有一定的影響，為此本文考察了不同流速(0.2～1.2 mL·min-1)的影響。發現流速越高，溶質被洗脫越快，保留時間變短，固定相與溶質間的作用時間縮短，分離度下降；當流速較低時，固定相與溶質能充分作用，但色譜峰會展寬。綜合考慮分離度和分析時間，流速設置為1 mL·min-1。同時發現進樣量太小，靈敏度低，受背景噪聲影響較大；而進樣量太大，容易造成柱超載，色譜峰變形(前沿或拖尾)，會影響分離度和峰面積定量的準確性，所以選擇一個適中的進樣量(2 μL)。

3.2 優化的分離條件

采用實驗室自制的橋聯β-環糊精柱，以甲醇-0.1%甲酸(32:68V/V)為流動相；柱溫為20 ℃；流速為1 mL.min-1；進樣量為2 μL；采用一級質譜和二級質譜選擇正離子檢測，具體的質譜參數見第2.4節所示。在上述優化的色譜條件下，對己唑醇對映體進行手性拆分和定量分析，分析時間均在20 min以內，得到了較滿意的實驗結果。已唑醇外消旋標準品溶液的色譜圖見圖2所示。

3.3 實際樣品的測定

3.3.1 標準工作曲線的制作

采用第2.3節中配制的己唑醇外消旋標準系列溶液，其中單一對映體濃度分別為0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,10 μg·L-1，按上述優化的色譜質譜條件進行測定，對單個對映體的峰面積(y)與相應濃度(x,μg·L-1)進行線性回歸，結果如下：

己唑醇第一個對映體：y=7.068×105x-3.052×105r2=0.993 3

己唑醇第二個對映體：y=7.332×105x-3.876×105r2=0.993 0

兩個己唑醇對映體在測定的濃度范圍(0.25～10 μg·L-1)具有良好的線性關系，按三倍信噪比(S/N=3) 推算出己唑醇的最低檢出限為0.017 μg·L-1。

3.3.2 回收率和精密度試驗

色譜方法開發出來，最終目的是應用到實際的農產品檢測中，由于含有已唑醇的實際樣品很難獲得。因此本實驗在臍橙空白基質中分別添加了一定量的己唑醇外消旋標準品，即得模擬樣品。對其進行回收率和重現性試驗，以便考察該方法的準確度和精密度。添加了低中高3種濃度水平(1,2,4 μg·L-1) 進行實驗，每個濃度水平都進行了5次平行測定，實驗結果如下：己唑醇第一個對映體平均RSD為2.12%，平均回收率為94.57%；己唑醇第二個對映體平均RSD為2.28%，平均回收率為92.46%；結果表明該對映體的定量方法有較高的精密度和準確性。添加外消旋已唑醇樣品的色譜圖見圖3所示。

4 結論

采用一種自制的新型橋聯β-環糊精柱和簡單的流動相可完全拆分己唑醇對映體，并結合高效液相色譜-質譜聯用法，能在短時間內(20 min) 快速測定臍橙中已唑醇對映體。該方法簡便，重現性好，成本低，實用性較強，可用于果蔬樣品中手性農藥對映體殘留量的檢測，為食品安全檢測提供了一種新分離材料和快速的LC-MS/MS分析方法。